CRISPR/Cas9技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的基因定點(diǎn)修飾技術(shù),它有制作簡(jiǎn)單、成本低、作用效果高等特點(diǎn)。精子載體法是生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一種簡(jiǎn)單有效的方法。本研究探討將精子攜帶法和CRISPR/Cas9技術(shù)結(jié)合,編輯獺兔的MSTN基因。本研究針對(duì)獺兔MSTN基因序列挑選2個(gè)靶位點(diǎn),并設(shè)計(jì)出2對(duì)sgRNA,構(gòu)建出2個(gè)MSTN基因編輯載體。然后將MSTN基因敲除載體和精子混合,再經(jīng)過(guò)人工受精方法試圖編輯獺兔的MSTN基因。結(jié)果顯示:2個(gè)MSTN基因敲除載體構(gòu)建成功,載體重要元件沒(méi)有出現(xiàn)缺失。本試驗(yàn)進(jìn)行人工授精的母兔32只。共有11只母兔懷孕,其中有3只母兔臨產(chǎn)死亡。試驗(yàn)中生產(chǎn)出47只仔兔,其中有10只仔兔因母兔臨產(chǎn)死亡導(dǎo)致沒(méi)有存活,經(jīng)過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)沒(méi)有得到基因編輯的獺兔。利用精子攜帶法能將基于CRISPR/Cas9技術(shù)編輯獺兔MSTN基因存在不穩(wěn)定性,本研究為進(jìn)一步獲得MSTN基因編輯獺兔進(jìn)行了探索,獲得了寶貴經(jīng)驗(yàn)。 

【文章來(lái)源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁(yè)數(shù)】：48 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

獺兔照片

圖 2 CRISPR/Cas9 工作機(jī)制Fig.2 The Working mechanism of CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9 的分類ISPR/Cas 系統(tǒng)中的 Cas 基因具有編碼核酸酶、聚合酶、解旋酶的作用，DNA 入侵起重要作用。根據(jù) Cas 蛋白之間進(jìn)化保守性及功能等因素 系統(tǒng)分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型[16]。Ⅰ型主要存在于細(xì)菌和古細(xì)菌；Ⅱ型只[24]；Ⅲ型大部分在古細(xì)菌發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌中很少見(jiàn)過(guò)。和 III 型較為復(fù)雜，都具有 CRISPR/Cas 系統(tǒng)共有的重要特征，都包含特酶（Cas）和 guide RNA，且需要多種蛋白共同作用。其中，Ⅰ型含 6性蛋白是 Cas3 蛋白，其可形成 CRISPR 相關(guān)病毒防御復(fù)合物 Cascad成核糖核蛋白[25]，從而使 crRNA 與雙鏈 DNA 形成 R 環(huán)結(jié)構(gòu)。其中與 c由 Cas3 的核酸酶切開(kāi)，另外一條由 Cas3 解旋酶和核酸酶切斷[26]。Ⅲ白，含有標(biāo)志性的 RAMP 蛋白，具有 RNA 酶功能，參與 crRNA 的成熟

組水平主要分為三部分：5’端的tracrRNA基因、中間的多種編碼Cas蛋白基因（CCas1、Cas2 和 Csn2）、3’端的 CRISPR 基因座（包括啟動(dòng)子區(qū)域、多個(gè)間隔序列-s及重復(fù)序列-repeats）。其中 tracrRNA 位點(diǎn)為反式調(diào)控激活 crRNA 位點(diǎn)（trans-actcrRNA，tracrRNA）。前體 crRNA（CRISPR-derived RNA）位點(diǎn)由間隔序列和重列相互間隔形成。Cas9 蛋白進(jìn)行 crRNA 的加工及對(duì)入侵核酸的降解。tracrRNA工后的 crRNA 結(jié)合形成 RNA 二聚體，在 Cas9 蛋白的引導(dǎo)下對(duì)外源核酸進(jìn)行特切割。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]不同被毛密度獺兔皮膚組織的差異表達(dá)基因篩選和CCNA2基因的多態(tài)性檢測(cè)及其與被毛密度的相關(guān)性研究[D]. 陳賽娟.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[2]山羊肌肉生長(zhǎng)抑制素基因多態(tài)性及其與生產(chǎn)性能相關(guān)性研究[D]. 劉錚鑄.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006

碩士論文
[1]用精子載體法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的研究[D]. 牟紅梅.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2002



本文編號(hào)：2964096