發(fā)布時間：2021-01-07 22:55

　　豬流行性腹瀉近年來的頻繁爆發(fā)及哺乳仔豬的高致死率不僅為豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失,同時也說明依賴主動免疫發(fā)揮作用的傳統(tǒng)疫苗（滅活疫苗、活疫苗等）對哺乳仔豬并無明顯效果,因此采用基因工程手段研制新型疫苗對豬流行性腹瀉的治療有積極意義。7-14日齡及以下仔豬免疫系統(tǒng)的不完善證明仔豬被動免疫的迫切性,因此本研究利用基因工程手段制備并檢測可用于口服的抗體。本研究在實驗室已有抗PEDV COE蛋白單鏈抗體sc Fv基因的基礎(chǔ)上,將單鏈抗體sc Fv序列在進行大腸桿菌原核表達優(yōu)化的同時在序列翻譯5’端加入一段纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（cellμLose binding domain,CBD）序列,然后構(gòu)建原核表達載體p ET19B-CBD-sc Fv。并對BL21/p ET19BCBD-sc Fv的搖菌條件進行優(yōu)化,研究了溫度、IPTG誘導(dǎo)劑量、誘導(dǎo)時間長度等因素對菌體生長和蛋白表達量的影響。采用硫酸水解法制備納米纖維素,50g纖維素紙加入500m L 64%的硫酸中,45℃水浴1h,反應(yīng)產(chǎn)物加入2.5L去離子水終止反應(yīng)后離心、透析、超聲后采用熱干燥法測所得納米纖維素濃度;將復(fù)性后CBD-sc Fv蛋白與... 

【文章來源】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)河南省

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

PCR擴增目的基因CBD-scFvNdeI、BanmHI雙酶切鑒定

D-scFv 由生工生物科技公司合成并進行大腸桿菌表達密碼子優(yōu)質(zhì)粒 pUC-sp-CBD-scFv 為模板 PCR 克隆出長度為 1101bp的 Cv 與質(zhì)粒 pET19b 同時進行 Nde I和 BanmH I雙酶切酶切，經(jīng)過9bp 的酶切片段 CBD-scFv（圖 2）和長度為 5705bp 的線性質(zhì)粒圖 2 PCR擴增目的基因 CBD-scFv Nde I 、BanmH I 雙酶切鑒定M:DL2000 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1,2,3： Nde I 、BanmH I 雙酶切 CBD-scFvFig.2 double enzyme digestion of CBD-scFvM: DL2000 DNA marker;1,2,3: Nde I 、BanmH I digestion of CBD-scFv

pET19b-CBD-scFv 酶切鑒定目的基因 CBD-scFv 分別進行雙酶切后連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，挑CR 鑒定為陽性的單克隆菌株提取質(zhì)粒并進行 EcoR I單酶切與 Bgl I粒全長為 6792bp，雙酶切結(jié)果理論條帶長度為 1259bp和 5533bp。792bp 的單一條帶與長為 1259bp和 5533bp 的雙酶切條帶（圖 4）。生物公司測序。

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
[1]抗豬流行性腹瀉病毒豬源化嵌合單鏈抗體scFv-Fc的構(gòu)建、表達及活性鑒定[D]. 宋曉峰.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[2]A型流感病毒單鏈抗體基因的克隆及抗病毒活性研究[D]. 李越.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[3]包含雙纖維素結(jié)合域（CBD）重組蛋白的分子構(gòu)建、表達及其吸附性能的研究[D]. 鄭斐.南京林業(yè)大學(xué) 2008



本文編號：2963399