豬流行性腹瀉近年來的頻繁爆發(fā)及哺乳仔豬的高致死率不僅為豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失,同時(shí)也說明依賴主動(dòng)免疫發(fā)揮作用的傳統(tǒng)疫苗（滅活疫苗、活疫苗等）對(duì)哺乳仔豬并無明顯效果,因此采用基因工程手段研制新型疫苗對(duì)豬流行性腹瀉的治療有積極意義。7-14日齡及以下仔豬免疫系統(tǒng)的不完善證明仔豬被動(dòng)免疫的迫切性,因此本研究利用基因工程手段制備并檢測(cè)可用于口服的抗體。本研究在實(shí)驗(yàn)室已有抗PEDV COE蛋白單鏈抗體sc Fv基因的基礎(chǔ)上,將單鏈抗體sc Fv序列在進(jìn)行大腸桿菌原核表達(dá)優(yōu)化的同時(shí)在序列翻譯5’端加入一段纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（cellμLose binding domain,CBD）序列,然后構(gòu)建原核表達(dá)載體p ET19B-CBD-sc Fv。并對(duì)BL21/p ET19BCBD-sc Fv的搖菌條件進(jìn)行優(yōu)化,研究了溫度、IPTG誘導(dǎo)劑量、誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)度等因素對(duì)菌體生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)量的影響。采用硫酸水解法制備納米纖維素,50g纖維素紙加入500m L 64%的硫酸中,45℃水浴1h,反應(yīng)產(chǎn)物加入2.5L去離子水終止反應(yīng)后離心、透析、超聲后采用熱干燥法測(cè)所得納米纖維素濃度;將復(fù)性后CBD-sc Fv蛋白與... 

【文章來源】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)河南省

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

PCR擴(kuò)增目的基因CBD-scFvNdeI、BanmHI雙酶切鑒定

D-scFv 由生工生物科技公司合成并進(jìn)行大腸桿菌表達(dá)密碼子優(yōu)質(zhì)粒 pUC-sp-CBD-scFv 為模板 PCR 克隆出長(zhǎng)度為 1101bp的 Cv 與質(zhì)粒 pET19b 同時(shí)進(jìn)行 Nde I和 BanmH I雙酶切酶切，經(jīng)過9bp 的酶切片段 CBD-scFv（圖 2）和長(zhǎng)度為 5705bp 的線性質(zhì)粒圖 2 PCR擴(kuò)增目的基因 CBD-scFv Nde I 、BanmH I 雙酶切鑒定M:DL2000 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1,2,3： Nde I 、BanmH I 雙酶切 CBD-scFvFig.2 double enzyme digestion of CBD-scFvM: DL2000 DNA marker;1,2,3: Nde I 、BanmH I digestion of CBD-scFv

pET19b-CBD-scFv 酶切鑒定目的基因 CBD-scFv 分別進(jìn)行雙酶切后連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，挑CR 鑒定為陽性的單克隆菌株提取質(zhì)粒并進(jìn)行 EcoR I單酶切與 Bgl I粒全長(zhǎng)為 6792bp，雙酶切結(jié)果理論條帶長(zhǎng)度為 1259bp和 5533bp。792bp 的單一條帶與長(zhǎng)為 1259bp和 5533bp 的雙酶切條帶（圖 4）。生物公司測(cè)序。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號(hào)：2963399