本研究旨在家雞上建立一種高效、穩(wěn)定的基因組定點編輯技術(shù)體系,實現(xiàn)目的基因定點敲除,為后續(xù)家雞基因編輯提供操作依據(jù)。基于NCBI數(shù)據(jù)庫提供的CDS序列克隆C2EIP（chr2,Expression In PGC）基因全長,并根據(jù)基因序列中APM的位置設計特異性gRNA1、gRNA2和gRNA3,并構(gòu)建cas9/gRNA載體;將設計好的cas9/gRNA轉(zhuǎn)染狀態(tài)良好的DF-1,利用Luciferase SSA重組檢測法、T7E1酶切法以及TA克隆測序法檢測gRNA在DF-1細胞中基因的敲除效率。Luciferase SSA重組檢測結(jié)果表明,只有cas9/gRNA3載體具有基因敲除活性,熒光活性比對照組高兩倍,T7E1酶切結(jié)果顯示cas9/gRNA3基因的敲除活性為27%,TA克隆測序結(jié)果表明,30個測序菌液中有8個菌液出現(xiàn)不同數(shù)目的堿基缺失或增加,初步估計基因敲除效率為26%。通過本研究在家雞中初步建立了cas9介導的基因敲除技術(shù),該技術(shù)能夠穩(wěn)定的在雞的細胞DF-1上介導基因敲除。 

【文章來源】：畜牧獸醫(yī)學報. 2016,47(06)北大核心

【文章頁數(shù)】：6 頁

【文章目錄】：
1 試驗材料與方法
    1.1 試驗材料
    1.2 試驗方法
        1.2.1 C2EIP基因克隆與靶位點選擇
        1.2.2 cas9/gRNA表達載體構(gòu)建
        1.2.3 DF-1細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
        1.2.4 Luciferase-SSA報告載體活性檢測
        1.2.5 T7E1酶切試驗
        1.2.6 TA克隆測序分析
2 結(jié)果
    2.1 C2EIP基因克隆與cas9/gRNA表達載體構(gòu)建
    2.2 Luciferase-SSA報告載體法檢測cas9/gRNA載體基因敲除活性
    2.3 T7E1酶切檢測靶向C2EIP cas9/gRNA3的活性
    2.4 TA克隆測序分析cas9/gRNA3基因敲除效率
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