本文關鍵詞：鴨源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及其CRISPR位點的分布和結(jié)構(gòu)特征，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida, PM)是一種引起畜禽發(fā)生出血性敗血癥或傳染性肺炎的病原菌,可在多種健康動物的口腔、咽部黏膜中存活。該菌廣泛分布于世界各地,對養(yǎng)鴨業(yè)造成重大經(jīng)濟影響。由于抗生素濫用,使該菌耐藥情況愈來愈嚴重。耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移是多殺性巴氏桿菌獲得耐藥性的主要方式之一,而原核細胞中發(fā)現(xiàn)的CRISPR-Cas系統(tǒng),能有效阻止基因水平轉(zhuǎn)移。為今后深入探究多殺性巴氏桿菌中CRISPR-Cas系統(tǒng)與其耐藥性之間的關系,本課題首次對多殺性巴氏桿菌中CRISPR序列結(jié)構(gòu)進行解析,并初步探討了CRISPR位點與多殺性巴氏桿菌耐藥情況之間的關系。本研究首先對來自4個不同規(guī)�；唸龅囊伤魄莼魜y病料剖檢,病鴨呈全身出血性敗血癥,心外膜、心冠脂肪大面積出血,全身黏膜、漿膜點狀出血,肝臟有針尖狀白色壞死灶等典型癥狀。經(jīng)麥康凱培養(yǎng)基篩選、革蘭染色、PCR、Biolog全自動微生物鑒定系統(tǒng),獲得4株臨床分離株均為多殺性巴氏桿菌,經(jīng)K-B紙片藥敏實驗均表現(xiàn)為多重耐藥。為進一步分析多殺性巴氏桿菌中CRISPR-Cas系統(tǒng)序列結(jié)構(gòu),先后提取4株臨床分離株及7株實驗室保存的多殺性巴氏桿菌全基因組,進行高通量測序,同時從NCBI下載11株多殺性巴氏桿菌全基因組序列,對總共22株多殺性巴氏桿菌基因組上的CRISPR-Cas系統(tǒng)進行比對。通過CRISPR-Cas系統(tǒng)分布情況,以及對先導序列、重復序列、間隔序列的分析,結(jié)果表明,在22株多殺性巴氏桿菌基因組上存在三種類型的CRISPR-Cas系統(tǒng)：Ⅰ-F型、Ⅱ-C型和Ⅲ-U型,且存在以下特征：1、每種CRISPR-Cas系統(tǒng)中,先導序列、重復序列及Cas蛋白三者之間相互影響；2、Ⅰ-F型系統(tǒng)中,重復序列第4位堿基突變對二級結(jié)構(gòu)影響最大,Ⅲ-U型系統(tǒng)中,重復序列第9位堿基突變對二級結(jié)構(gòu)影響最大；3、在三種系統(tǒng)中,共1314個間隔序列,但僅一例多殺性巴氏桿菌噬菌體F108與間隔序列匹配；4、不同地理位置分離的菌株,所包含的間隔序列數(shù)量存在差異。同時,為了解目前生產(chǎn)中多殺性巴氏桿菌的耐藥情況與CRISPR位點之間的聯(lián)系,本研究著重分析了4株臨床分離株,結(jié)果顯示間隔序列越少,菌株耐藥性越強。本次研究對以后深入分析生產(chǎn)中多殺性巴氏桿菌的CRISPR-Cas系統(tǒng)與細菌耐藥機制,特別是基因水平轉(zhuǎn)移情況有重要意義,同時也為研究CRISPR與細菌毒力之間的關系、流行病檢測、Cas蛋白等有關應用提供基礎依據(jù)。
【關鍵詞】：多殺性巴氏桿菌 分離鑒定 高通量測序 CRISPR-Cas系統(tǒng) 耐藥性
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 縮略詞表7-10
• 第一部分 文獻綜述10-19
• 1. 多殺性巴氏桿菌研究概況10-13
• 1.1 多殺性巴氏桿菌分類地位10
• 1.2 多殺性巴氏桿菌形態(tài)及染色特性10
• 1.3 多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)及生化特性10-11
• 1.4 多殺性巴氏桿菌血清型11
• 1.5 多殺性巴氏桿菌抵抗力11
• 1.6 多殺巴氏桿菌的致病性及免疫性11-12
• 1.7 多殺巴氏桿菌的流行病學12
• 1.8 多殺性巴氏桿菌基因組學研究概況12-13
• 2. CRISPR-CAs系統(tǒng)研究概況13-18
• 2.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)研究進展13-14
• 2.2 先導序列14
• 2.3 重復序列14
• 2.4 間隔序列14-15
• 2.5 Cas蛋白家族及CRISPR-Cas系統(tǒng)的分布及分類15-16
• 2.6 CRISPR-Cas系統(tǒng)的作用機制16
• 2.7 CRISPR-Cas系統(tǒng)與噬菌體的共進化16-17
• 2.8 CRISPR-Cas系統(tǒng)的生物信息學分析17-18
• 3. 研究目的及意義18-19
• 第二部分 鴨源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定19-32
• 1. 試驗材料19-21
• 1.1 菌株19-20
• 1.2 主要材料20-21
• 2. 實驗方法21-27
• 2.1 臨床分離株的分離培養(yǎng)及純化21-22
• 2.2 臨床分離株的革蘭染色22
• 2.3 Biolog全自動細菌鑒定儀鑒定22-25
• 2.3.1 菌懸液制備22-23
• 2.3.2 微平板的接種于培養(yǎng)23-25
• 2.4 16S rDNA分子生物學鑒定25-26
• 2.5 Kirby-Bauer(K-B)藥敏實驗26-27
• 3. 結(jié)果27-31
• 3.1 分離結(jié)果27
• 3.2 培養(yǎng)特性27-28
• 3.3 革蘭染色結(jié)果28
• 3.4 Biolog全自動細菌鑒定結(jié)果28-29
• 3.5 PCR鑒定結(jié)果29-30
• 3.6 耐藥結(jié)果30-31
• 4. 討論31-32
• 第三部分 鴨源多殺性巴氏桿菌中CRISPR-CAS系統(tǒng)的生物信息學分析32-56
• 1. 11株多殺性巴氏桿菌全基因組測序32-34
• 2. CRISPR-CAS系統(tǒng)的生物信息學分析結(jié)果34-48
• 2.1 測序結(jié)果34-35
• 2.2 CRISPR位點的分布35-37
• 2.3 先導序列的分析37-38
• 2.4 重復序列的分析38-43
• 2.5 間隔序列的分析43-45
• 2.6 Cas蛋白基因簇的分析45-48
• 3. 討論48-56
• 3.1 多殺性巴氏桿菌中CRISPR-Cas系統(tǒng)序列結(jié)構(gòu)特征48-54
• 3.2 CRISPR位點與菌株耐藥關系的初步探討54-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻57-64
• 致謝64

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