發(fā)布時間：2020-12-24 00:42

　　奶牛乳腺炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)最常見的疾病之一,臨床上常有較高的發(fā)病率。當(dāng)環(huán)境中的致病菌侵入奶牛乳腺突破乳腺上皮緊密連接形成的物理屏障后,在乳腺內(nèi)急劇繁殖擴增,導(dǎo)致血乳屏障破壞進而引發(fā)奶牛乳腺的炎癥反應(yīng)。近年來的研究發(fā)現(xiàn),長鏈非編碼RNA（long non coding RNA,lncRNA）在多種炎癥過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用,但其是否參與奶牛乳腺的炎癥反應(yīng)過程鮮有報道。實驗室前期通過高通量測序發(fā)現(xiàn)一個lncRNA,該lncRNA在大腸桿菌處理的奶牛乳腺上皮細胞中顯著下調(diào)。因在染色體上位于其相鄰的編碼蛋白基因富亮氨酸重復(fù)序列75A蛋白（leucine-rich repeat-containing protein 75A,LRRC75A）的反義鏈,且部分與LRRC75A基因互補,故將這條LncRNA命名為LRRC75A反義鏈lncRNA1（LRRC75A-AS1）。本研究通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除LRRC75A-AS1在奶牛乳腺上皮細胞中的降低,通過一系列分子生學(xué)方法和手段研究其在奶牛乳腺上皮細中的作用及機制。實驗取得如下結(jié)果:1.在炎癥狀態(tài)下,LRRC75A-AS1在奶牛乳腺組織和乳... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要符號對照表
第一章 文獻綜述
    1.1 奶牛乳腺炎的研究進展
        1.1.1 奶牛乳腺炎概況
        1.1.2 奶牛乳腺炎的細胞免疫機制
        1.1.3 奶牛乳腺炎的預(yù)防與治療
    1.2 LncRNA的研究現(xiàn)狀
        1.2.1 LncRNA概述
        1.2.2 LncRNA在疾病中的研究進展
        1.2.3 LncRNA與炎癥通路
    1.3 緊密連接研究進展
        1.3.1 緊密連接概述
        1.3.2 緊密連接蛋白
第二章 LncRNA LRRC75A-AS1 對奶牛乳腺上皮細胞的生物學(xué)特性及功能的影響
    2.1 材料
        2.1.1 乳腺組織和細胞
        2.1.2 儀器設(shè)備
        2.1.3 試劑
    2.2 方法
        2.2.1 主要溶液的配制
        2.2.2 乳腺上皮細胞的復(fù)蘇
        2.2.3 乳腺上皮細胞的傳代培養(yǎng)
        2.2.4 乳腺上皮細胞的凍存
        2.2.5 細菌的滅活與使用
        2.2.6 乳腺組織和細胞RNA提取
        2.2.7 實時熒光定量PCR
        2.2.8 酶聯(lián)免疫吸附實驗
        2.2.9 蛋白和RNA核質(zhì)分離實驗
        2.2.10 電轉(zhuǎn)染siRNA干擾片段
        2.2.11 cDNA末端快速克隆RACE
        2.2.12 CRISPR-Cas9 質(zhì)粒以及過表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.13 免疫熒光
        2.2.14 細胞增殖實驗
        2.2.15 彗星實驗
        2.2.16 細菌黏附和侵襲實驗
        2.2.17 細胞膜通透性實驗
        2.2.18 雙熒光素酶報告實驗
        2.2.19 蛋白印跡實驗
        2.2.20 統(tǒng)計分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 LRRC75A-AS1 在乳腺組織和上皮細胞中的表達水平
        2.3.2 穩(wěn)定敲除LRRC75A-AS1 的乳腺上皮細胞系的建立
        2.3.3 穩(wěn)定敲除LRRC75A-AS1對MAC-T細胞形態(tài)的影響
        2.3.4 敲除LRRC75A-AS1 促進MAC-T細胞β-酪蛋白的分泌
        2.3.5 敲除LRRC75A-AS1 對細胞增殖和DNA損傷的影響
        2.3.6 LRRC75A-AS1 的敲除增強緊密連接蛋白的表達
        2.3.7 LRRC75A-AS1 敲除降低細胞膜通透性并抑制細菌黏附和侵襲
        2.3.8 敲除LRRC75A-AS1 抑制炎性應(yīng)答
        2.3.9 LRRC75A-AS1 正調(diào)控LRRC75A的表達
        2.3.10 LRRC75A負(fù)調(diào)控緊密連接蛋白的表達
        2.3.11 LRRC75A影響細胞通透性以及細菌的黏附和侵襲
        2.3.12 LRRC75A影響NF-κB通路的激活
    2.4 討論
全文結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝
作者簡介



本文編號：2934646