綿羊肺腺瘤病毒（JSRV）引發(fā)的綿羊肺腺瘤�。∣PA）,是綿羊的一種慢性進(jìn)行性傳染性肺臟腫瘤疾病。JSRV具有與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒相似的結(jié)構(gòu)和基因組,基因組包含了編碼病毒衣殼結(jié)構(gòu)蛋白的gag基因,編碼天冬氨酸蛋白酶（PR）的pro基因,編碼逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）和整合酶（IN）的pol基因以及編碼存在與病毒粒子表面的囊膜蛋白（Env）的env基因。其中囊膜蛋白主要負(fù)責(zé)病毒粒子與病毒的靶細(xì)胞的特異性結(jié)合,同時發(fā)生膜融合使病毒粒子侵入靶細(xì)胞內(nèi),是主要的致癌蛋白。為了進(jìn)一步探索exJSRV囊膜蛋白的功能,從而揭示JSRV的致癌機(jī)制。本研究以自然感染的OPA的病肺組織為原料提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,構(gòu)建含完整的外源性綿羊肺腺瘤病毒囊膜基因（exISRV-env）的重組質(zhì)粒pcDNA4/myc-His/exJSRV-env,并通過PCR、酶切和核酸測序方法鑒定其正確性。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組質(zhì)粒pcDNA4/myc-His/exJSRV-env瞬時轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞,利用RT-PCR和Western blot方法檢測Env的表達(dá),利用CCK-8法和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測囊膜蛋白Env表達(dá)對NIH3... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：51 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
1 引言
    1.1 綿羊肺腺瘤概述
    1.2 綿羊肺腺瘤病毒
    1.3 JSRV囊膜蛋白
    1.4 JSRV囊膜蛋白引起的致癌信號通路
    1.5 研究OPA發(fā)病機(jī)制的實(shí)驗(yàn)方法
        1.5.1 羔羊體內(nèi)疾病模型
        1.5.2 自然感染的OPA
        1.5.3 小鼠體內(nèi)腫瘤模型
        1.5.4 體外細(xì)胞培養(yǎng)模型
        1.5.5 OPA的體外肺片模型
    1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
    1.7 檢測細(xì)胞增殖的方法
        1.7.1 檢測代謝活性
        1.7.2 檢測DNA合成
        1.7.3 檢測ATP濃度
        1.7.4 檢測增殖標(biāo)志
    1.8 研究目的與意義
2 試驗(yàn)一 綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白真核表達(dá)載體pcDNA4/myc-His/exJSRV-env構(gòu)建及鑒定
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 主要材料
        2.1.2 主要儀器
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 設(shè)計(jì)引物
        2.2.2 exJSRV-env的克隆
        2.2.3 目的基因的純化
        2.2.4 S組質(zhì)粒pcDNA4/myc-His/exJSRV-enw的構(gòu)建及鑒定
    2.3 結(jié)果
        2.3.1. exJSRV-env的克隆
        2.3.2 pcDNA4/myc-His/exJSRV-env構(gòu)建及鑒定結(jié)果
        2.3.3 測序結(jié)果
    2.4 討論
3 試驗(yàn)二 pcDNA4/myc-His-exJSRV-env瞬時轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞
    3.1 試驗(yàn)材料
        3.1.1 主要材料
        3.1.2 主要儀器
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 復(fù)蘇NIH3T3細(xì)胞
        3.2.2 細(xì)胞傳代
        3.2.3 pcDNA4/myc-His/exJSRV-env瞬時轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞
        3.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后exJSRV-env mRNA表達(dá)的檢測
        3.2.5 Western blot檢測Env在NIH 3T3細(xì)胞中的表達(dá)
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 pcDNA4/myc-His/exJSRV-env轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞后目的基因的檢測
        3.3.2 Western blot檢測Env的表達(dá)情況
    3.4 討論
4 試驗(yàn)三 瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA4/myc-His-exJSRV-env對NIH3T3細(xì)胞的影響
    4.1 試驗(yàn)材料
        4.1.1 主要材料
        4.1.2 主要儀器
    4.2 試驗(yàn)方法
        4.2.1 CCK8法檢測細(xì)胞體外增殖能力
        4.2.2 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)
        4.2.3 Western blot檢測EGFR
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 CCK8法檢測細(xì)胞增殖
        4.3.2 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)
        4.3.3 Western blot檢測EGFR
    4.4 討論
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
作者簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]綿羊肺腺瘤病毒pEGFP-C1/exJSRV-env構(gòu)建及引起NIH3T3細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的研究[J]. 張宇飛,劉月,王專家,孫曉林,劉淑英.  病毒學(xué)報(bào). 2014(03)



本文編號：2924044