發(fā)布時(shí)間：2020-12-15 03:41

　　馬爾堡病毒和埃博拉病毒屬于絲狀病毒屬,絲狀病毒科,為單股負(fù)鏈非節(jié)段RNA病毒,基因組約19kb。該病毒能引起人和非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物極其嚴(yán)重的馬爾堡出血熱或埃博拉出血熱,主要癥狀為多臟器衰竭、天然孔出血、嘔血等,死亡率50～90%。由于馬爾堡及埃博拉病毒爆發(fā)區(qū)域重疊,癥狀相似,為防控該兩種病毒感染,我們開(kāi)展同時(shí)針對(duì)兩種病毒的疫苗研究。馬爾堡病毒及埃博拉病毒的表面囊膜糖蛋白為疫苗開(kāi)發(fā)的最主要抗原,而水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus,VSV）作為疫苗載體,則具有免疫劑量低、安全高效、無(wú)預(yù)存免疫等優(yōu)點(diǎn)。因此我們選擇安哥拉型馬爾堡病毒（Angola Marburg virus glycoprotein,MGP）和扎伊爾型埃博拉（Zaire Ebola virus glycoprotein,ZGP）及其前期篩選的高免疫原性片段GP2A及L,構(gòu)建二價(jià)重組VSV載體疫苗。免疫Balb/c小鼠,測(cè)定小鼠血清抗體及淋巴細(xì)胞因子等評(píng)價(jià)潛在的免疫保護(hù)作用。1,成功構(gòu)建6種VSV重組質(zhì)粒和拯救3種VSV重組病毒。將MGP、GP2Δ、ZGP和L通過(guò)不同組合,克隆至VSVΔG載體,替... 

【文章來(lái)源】：揚(yáng)州大學(xué)江蘇省

【文章頁(yè)數(shù)】：70 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖２－１載體構(gòu)建示意圖??２．１材料??

２．３．２病毒拯救結(jié)果??骨架質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒按比例與轉(zhuǎn)染試劑混合后加入細(xì)胞中拯救病毒，經(jīng)盲傳，細(xì)胞產(chǎn)??生病變：不黏連，變圓，皺縮（圖２－４），與正常細(xì)胞之間形成鮮明對(duì)比，說(shuō)明有病毒的產(chǎn)??生，將重組病毒分別命名為?ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－ＺＧＰ、ｒＶＳＶＡＧ－ＧＰ２Ａ－Ｌ?和?ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－Ｌ。??■■??．參囊論ｕ：，：丄＇??圖２－４病毒包裝盲傳后細(xì)胞形態(tài)對(duì)照??注：圖Ａ陰性對(duì)照ＢＨＫ２１ＷＩ２細(xì)胞；圖ＢｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－ＺＧＰ盲傳于ＢＨＫ２１ＷＩ２細(xì)胞；圖Ｃ??ｒＶＳＶＡＧ－ＧＰ２Ａ－Ｌ?盲傳于?ＢＨＫ?２１?Ｗ１２?細(xì)胞；圖?Ｄ?ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－Ｌ?盲傳于?ＢＨＫ?２１?ＷＩ２?細(xì)胞。??２．３．３病毒ＲＴ－ＰＣＲ的鑒定??病毒?ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－ＺＧＰ、ｒＶＳＶＡＧ－ＧＰ２Ａ－Ｌ?和?ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－Ｌ?感染細(xì)胞后收集上清??提�。遥危�，經(jīng)ＤＮＡ酶Ｉ消化，反轉(zhuǎn)錄為ｃＤＮＡ后，使用反轉(zhuǎn)錄引物（ＭＺ?ｍｉｄｄｌｅ?Ｆ，ＭＺ?ｍｉｄｄｌｅ??Ｒ）、（ＧＰ２Ａ－ＬＦ，?ＧＰ２Ａ－ＬＲ）和（ＭＧＰ－ＬＦ，?ＭＧＰ－ＬＲ）分別擴(kuò)增以上病毒的插入基因；??使用反轉(zhuǎn)錄引物（ＶＳＶ－ＭＦ，?ＶＳＶ－ＭＲ）擴(kuò)增以上病毒中ＶＳＶ骨架的Ｍ基因。??核酸瓊脂糖凝膠電泳（圖２－５）結(jié)果表明，病毒ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－ＺＧＰ基因組中含有ＭＧＰ??和ＺＧＰ序歹ｉｊ，ｒＶＳＶＡＧ－ＧＰ２Ａ－Ｌ基因組中含有ＧＰ２Ａ—Ｌ序列，ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－Ｌ基因組中含??有ＭＧＰ－Ｌ序列

ＭＯＩ＝０．０１的病毒液感染細(xì)胞后，每１２ｈ取細(xì)胞上清，根據(jù)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)病毒的ＴＣＩＤ５０??繪制柄毒體外生長(zhǎng)曲線，可以看出病毒感染后４８ｈ－６０ｈ滴度最聞。病毒整個(gè)增殖的過(guò)程也??符合實(shí)際病毒先增后減的趨勢(shì)（圖２－８）。??ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－ＺＧＰ??ｇ３－??５１＿?嚷??〇?Ｉ?＼?Ｖ?１?１?＼?Ｔ?Ｉ?１??０?１２?２４?３６?４８?￡０?７２?２４?０６??Ｔｉｍｅ?（ｈ）??圖２－８?ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－ＺＧＰ重組病毒體外生長(zhǎng)曲線??２．４討論與小結(jié)??前期構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)，連接插入基因之間的是口蹄疫病毒基因組的２Ａ序列，得到質(zhì)粒??ｐＶＳＶＡＧ－ＭＧＰＲ－２Ａ－Ｌ、ｐＶＳＶＡＧ－ＭＧＰＭ－２Ａ－Ｌ?和?ｐＶＳＶＡＧ－ＺＧＰ－２Ａ－Ｌ，該?２Ａ?序列在翻譯??為蛋白后，具有自裂解功能，能將其前后連接的蛋白一分為二，但裂解不充分或者其中一??種蛋白表達(dá)量明顯過(guò)低是其重要缺點(diǎn)［１８８，１８９］。此三種質(zhì)粒未拯救出病毒。后經(jīng)過(guò)多次查閱??文獻(xiàn)和大量實(shí)驗(yàn)摸索，將插入基因之間的連接序列改為ＶＳＶ基因間的保守序列一轉(zhuǎn)錄終??止起始序列，據(jù)報(bào)道，此序列能提高ＶＳＶ重組病毒拯救效率及穩(wěn)定性１｜８７１。故構(gòu)建新的重??組質(zhì)粒?ｐＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－ＺＧＰ、ｐＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－Ｌ?和?ＰＶＳＶＡＧ－ＧＰ２Ａ－Ｌ，并在相同的病毒拯救??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]高等級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室在生物安全領(lǐng)域的作用及其發(fā)展的思考[J]. 劉靜,李超,柳金雄,何蕊,孫燕榮.  中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2020(01)
[2]Tim-1抗體在防治埃博拉及馬爾堡病毒感染中的作用研究[J]. 張艷玲,李淑蓮,李葛,竇帥杰,劉藝瓊,張嘉誠(chéng),李國(guó)賢,侯春梅,馮健男,沈倍奮,韓根成.  軍事醫(yī)學(xué). 2018(12)



本文編號(hào)：2917587