新孢子蟲病是由犬新孢子蟲寄生于牛、羊和犬等多種動物有核細胞內(nèi)引起的一種原蟲病。機體感染犬新孢子蟲后幾天內(nèi)會發(fā)生的壞死性病變,并通過細胞內(nèi)速殖子的增殖導致細胞死亡。典型癥狀是母畜流產(chǎn),死胎以及新生胎兒運動障礙。該病是一種世界范圍性的疾病,分布廣泛,在澳大利亞,日本,韓國以及我國的多個省份都有發(fā)現(xiàn),給畜牧業(yè)的經(jīng)濟發(fā)展帶來了巨大影響。但現(xiàn)今仍缺乏有效的疫苗來預防新孢子蟲病,研究新孢子蟲的入侵機制和抗原蛋白對新孢子蟲病的預防和診斷有參考價值。酵母雙雜交技術是目前廣泛應用研究一種已知蛋白與另一種已知或未知蛋白之間的相互作用情況,具有簡潔性和高敏感性。構建誘餌載體是本試驗的重要步驟,首先構建pGBKT7-NcGRA7載體,為進一步研究與NcGRA7基因互作的蛋白奠定基礎。本試驗通過PCR方法擴增NcGRA7基因,回收的NcGRA7基因先與pMD19T Simple載體連接,轉化到DH5α中,進行PCR鑒定和酶切鑒定,以獲得含有EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ兩種限制性內(nèi)切酶酶切位點的正確的NcGRA7基因。將pGBKT7載體用EcoRⅠ和Sal Ⅰ兩種限制性內(nèi)切酶酶切,獲得兩端分別含有這兩種酶切位點的pGBKT7載體。并將含有相同酶切位點的NcGRA7基因和pGBKT7載體進行連接,轉化到DH5α中,篩選出PCR鑒定和酶切鑒定均正確的pGBKT7-NcGRA7重組質(zhì)粒,進行測序,與GenBank上的NcGRA7基因序列有100%的同源性。本試驗成功地構建了 pGBKT7-NcGRA7誘餌載體,為下一步NcGRA7相互作用蛋白的初步篩選奠定基礎。為了保證后續(xù)篩選實驗中能獲得理想的結果,首先要對之前構建的誘餌載體pGBKT7-NcGRA7進行自轉錄活性和細胞毒性檢測。鑒定結果顯示構建的誘餌載體pGBKT7-NcGRA7無自轉錄活性,無細胞毒性。將誘餌載體pGBKT7-NcGRA7與Vero細胞cDNA文庫進行雜交篩選,獲得234個藍斑克隆,經(jīng)PCR鑒定,質(zhì)粒提取,轉化測序等操作后,獲得4個陽性質(zhì)粒,分別為18S核糖體RNA,70kDa熱休克蛋白8,NADH脫氫酶亞基1(線粒體),低聚糖轉移酶復合物。
【學位單位】：延邊大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：Q78;S852.7
【部分圖文】：

３．２?ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７的ＰＣＲ鑒定與酶切鑒定??ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７的連接產(chǎn)物轉入大腸桿菌感受態(tài)中，克隆培養(yǎng)，菌落ＰＣＲ??鑒定，目的基因片５７０ｂｐ，如圖２所示。??１?２?３?４?Ｍ??＿??“‘福麵??圖２?ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７的ＰＣＲ鑒定結果??Ｍ：?ＤＬ５?０００Ｍａｒｋｅｒ；?１、２、３：?ＮｃＧＲＡ７?擴增產(chǎn)物：４：空白對照??Ｆｉｇ．２?Ｔｈｅ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７?ｂｙ?ＰＣＲ??Ｍ：?ＤＬ５?０００?Ｍａｒｋｅｒ；?Ｋ?２＞?３：?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＮｃＧＲＡ７?ｇｅｎｅ；?４：Ｃｏｎｔｒａｓｔ??１５??

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圖３?ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７雙酶切鑒定??Ｍ：?ＤＬ５?０００?Ｍａｒｋｅｒ；?ｈ?ＮｃＧＲＡ７；?２：空白對照??ｅｎｔｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７?ｂｙ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ?ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ?ｄｉｇＤＬ５?０００?Ｍａｒｋｅｒ；?１?：?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＮｃＧＲＡ７?ｇｅｎｅ；?２：Ｃｏｎｔ析??后，結果顯示序列與ＮＣＢＩ中ＮｃＧＲＡ７序列同源列如圖４所不。??１０?２０?３０?４０?ＳＯ?６Ｄ??Ａ＇ＧＡＡＴＴ?ＯＧ?ＡＧＡ?ＴＴＧＯＣＡ?Ａ?ＧＡＡ：ＡＧ：?ＡＴＧＡＡＧＧＧＧＡ?．．?ＡＴ?ＧＧＡ．ＴＡＴ?ＧＧＧＧＴＴＡＧＧＧ??７０?８０?９０?１００?１１０?１２０??ＡＴＡＴＧ＇＾ＧＧ?：ＧＴＴＴ?ＡＪｌＡＣ?ＴＡＴＧＡ?：ＧＧｖ?Ｇ?ｋＴＧｋ＇ＯｋＴＯ：．?ＴＧＣ．ＡＧＧＡＡＡ?ＴＧＴ．ＧｆＴ??１３０?１４０?１５０?１６０?１７０?１８０??ＣＧＧＡＴＧＴＧＡ?．?ＴＧＡＣＧＡＴＧＣＣ?ＡＴＴＡ?夂ＧＡＴＧ?ＧＴＧＡＧＴＧＧＣＣ?Ａ?Ｃ’ＴＧＴＴＧＴＡ?Ｔ：ＧＧＧＧｆＡＧＡ??１９０?２００?２１０?２２０?２３０?２４０??ＡＧＣｖＧＣＡ?Ａ＇?ＧＡＣＴ?ＡＧＡＡＡ?ＧＧ＇ｌＡＧ?ＴＴＧＡ?Ｔ?．＾ＧＡＡＧ＾Ｔ?ＧＧ?ＡＧＴＡ?Ｇ?ＧＴＧＧＴＣＧＧＣＧ??２５０?２６０?２７０?２８０?２ＳＯ?３００??＂ＴＣＴＴＡＣＧＴ．－?ＧＴＡＴ?ＴＴＧＴＴ?Ｇ?ＴＧＡ－ＡＧＧＧ?ＴＧ?ＴＧ?ＧＡ?ＧＴＴＧＡ；ＴＴ?Ｔ?Ｇ?：?ＡＧＡＡＧＡＡ０??３１０?３２０?３３０?３４０?３Ｓ０?３?６０??－－
【參考文獻】

相關博士學位論文 前3條

1 馬磊;新孢子蟲ROP5和ROP16的功能及作用機制[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2017年

2 李文生;新孢子蟲MIC6的鑒定、功能及其作用機制的初步研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2015年

3 賈立軍;牛源犬新孢子蟲NcSRS2-NcGRA7復合基因核酸疫苗與重組腺病毒疫苗的研究[D];延邊大學;2012年

相關碩士學位論文 前3條

1 楊東升;新孢子蟲NcMIC2-like1重組蛋白對小鼠新孢子蟲感染的免疫保護作用[D];吉林大學;2016年

2 郭煥平;牛源犬新孢子蟲AMA1基因核酸疫苗與重組腺病毒疫苗的制備及動物免疫[D];延邊大學;2014年

3 甘甜;CG31007基因誘餌質(zhì)粒的構建與檢測[D];湖北大學;2014年

本文編號：2892915