發(fā)布時間：2020-11-18 22:44

　　 剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種重要的人畜共患病原體,免疫功能缺陷的人或者動物感染后會引起急性臨床癥狀,如發(fā)燒、肺炎和心肌炎等。此外,弓形蟲能夠通過孕婦或者孕畜發(fā)生垂直傳播,引起胎兒腦炎、視網(wǎng)膜炎甚至更嚴重的后果。為研制出安全有效的疫苗,目前已開展了多種弓形蟲毒力相關(guān)蛋白的研究,如致密顆粒蛋白(dense granules,GRAs)和棒狀體蛋白(rhoptry protein,ROP)等。研究發(fā)現(xiàn),冷休克蛋白(Cold Shock Proteins,CSPs)在細菌、植物和動物細胞中能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯過程,在沙門菌(Salmonella)等病原入侵宿主細胞的過程中,CspC和CspE參與調(diào)控基因的表達,而且在細菌的運動性、膜形成和毒力方面發(fā)揮重要作用。此外,CSPs對植物細胞的生長發(fā)育和動物細胞的增殖和遷移都發(fā)揮著重要作用。但是,目前尚沒有關(guān)于弓形蟲CSPs的研究�；诖�,本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了弓形蟲冷休克蛋白Tgcsp2基因缺失株,通過探究其表型及轉(zhuǎn)錄組的變化來分析弓形蟲Tgcsp2基因的功能。1.成功構(gòu)建了弓形蟲Tgcsp2基因缺失株(RH-ΔTgcsp2):本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)在弓形蟲RH速殖子的靶基因中插入了抗性片段,藥物篩選后通過診斷PCR和熒光定量PCR進行鑒定發(fā)現(xiàn),與RH野生株相比,RH-ΔTgcsp2蟲株的Tgcsp2基因確有抗性片段的插入。2.研究了弓形蟲RH-ΔTgcsp2蟲株的表型:將體外培養(yǎng)的弓形蟲RH速殖子和RH-ΔTgcsp2速殖子分別感染人包皮成纖維細胞(Human foreskin fibroblast,HFF),發(fā)現(xiàn)RH-ΔTgcsp2蟲株形成的空斑數(shù)較RH株少,且空斑較小;將不同劑量的蟲體接種于長滿HFF細胞的96孔板中,發(fā)現(xiàn)RH-ΔTgcsp2株對宿主細胞造成的裂解程度明顯小于野生株;間接免疫熒光試驗發(fā)現(xiàn)RH-ΔTgcsp2速殖子的入侵率少于RH速殖子,Tgcsp2基因的缺失影響弓形蟲在宿主細胞內(nèi)的增殖能力,并且RH-ΔTgcsp2蟲株的逸出能力也有所減弱;動物試驗發(fā)現(xiàn)RH-ΔTgcsp2蟲株感染的小鼠比野生型RH蟲株感染的小鼠存活時間長。3.獲得了弓形蟲RH-ΔTgcsp2蟲株的轉(zhuǎn)錄組:為了進一步探究Tgcsp2基因的缺失對RH蟲株基因表達的影響,本研究利用RNA-seq技術(shù)對RH-ΔTgcsp2蟲株和RH野生株進行轉(zhuǎn)錄組測序,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在RH-ΔTgcsp2蟲株和RH蟲株分別有7392個和7492個基因表達;與RH株相比,有169個基因只在RH-?Tgcsp2蟲株中特異表達,有5000個基因在該蟲株中差異表達(上調(diào)轉(zhuǎn)錄本有2582個,下調(diào)轉(zhuǎn)錄本有2418個),但有269個基因不表達。功能分析發(fā)現(xiàn)差異表達基因富集于3873個GO條目和72條KEGG通路中,GO分析發(fā)現(xiàn)它們可能主要參與代謝、催化和生物合成的調(diào)節(jié),而KEGG分析發(fā)現(xiàn)它們可能與蛋白質(zhì)加工、蛋白酶體、DNA復制、生物合成和弓形蟲病發(fā)生等相關(guān)。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)Tgcsp2基因的缺失會減弱弓形蟲RH蟲株的入侵、胞內(nèi)增殖和逸出能力,并減弱RH蟲株對小鼠的毒力。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),這些變化可能與其基因表達相關(guān)。這些研究結(jié)果為深入研究TgCSP2蛋白的作用機制奠定了基礎(chǔ),為設(shè)計弓形蟲致弱蟲株疫苗提供了理論依據(jù)。
【學位單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S852.72
【部分圖文】：

0；1. pSAG1::CAS9-U6::sgTgc. The plasmid pSAG1::CAS9-U62-1 pSAG1::CAS9-U6::Tgcsp2 1 The plasmid pSAG1::CAS9-U6擴增結(jié)果現(xiàn)目的條帶與 DHFR*抗性標

s9系統(tǒng)構(gòu)建RH- Tgcsp2蟲株的示意圖；b. PCR鑒定m of constructing RH- Tgcsp2 strain using the CRISidentification; c. Real-time PCR identification圖 2-3 RH-ΔTgcsp2蟲株的構(gòu)建及鑒定. 2-3 Generation and identification of RH-ΔTgcsp2 s果Tgcsp2速殖子感染HFF細胞后發(fā)現(xiàn)，RH-ΔT量顯著減少（P<0.01）（圖2-4）。

圖 2-5 RH-ΔTgcsp2與RH蟲株對HFF細胞的裂解情況Fig. 2-5 HFF cell lysis of RH-ΔTgcsp2 and RH strain注：*代表 P<0.05，***代表P<0.001Note: *means P<0.05, ***means P<0.001果光對野生型RH株和RH-ΔTgcsp2進行入侵試驗發(fā)生型RH株（圖2-6b）。
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本文編號：2889312