豬瘟(CSF)是一種由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一種豬群疫病,每年對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。為了解2016-2017年度山東省CSF流行清況,本文對(duì)2016-2017年度CSF抗原、抗體進(jìn)行檢測(cè)。2016年共檢測(cè)疑似CSF感染組織樣品2297份,其中檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果樣本數(shù)為230份,陽(yáng)性率為10.01%。2017年共檢測(cè)疑似CSF感染組織樣品784份,其中檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果樣本數(shù)為67份,陽(yáng)性率為8.55%。2016年共檢測(cè)血液抗體樣品9713份,其中CSF陽(yáng)性抗體樣本數(shù)為7744份,陽(yáng)性率為79.73%。2017年共檢測(cè)血液抗體樣品6887份,其中CSF陽(yáng)性抗體樣本數(shù)為5839份,陽(yáng)性率為84.78%。檢測(cè)結(jié)果顯示,2017年相較于2016年抗原感染率下降,抗體陽(yáng)性率上升。對(duì)2016-2017年送檢樣品中的抗原陽(yáng)性病料,根據(jù)地域和時(shí)間差異進(jìn)行毒株分離,最終分離到8株CSFV野毒株,將所有分離毒株E2基因進(jìn)行序列遺傳進(jìn)化分析,結(jié)果顯示8株野毒株均為2.1d基因亞群,表明目前在山東省內(nèi)廣泛、持續(xù)性的存在2.1d基因亞群CSFV。同時(shí),本研究對(duì)野毒株SDWF 2016進(jìn)行了全基因組序列測(cè)定。單克隆抗體因?yàn)槠涮禺愋院兔舾行粤己玫葍?yōu)點(diǎn),在CSFV的診斷以及分子生物學(xué)研究方面有重要作用。本文根據(jù)分離毒株SDWF 2016的E2基因主要抗原區(qū)段,構(gòu)建質(zhì)粒進(jìn)行原核表達(dá)蛋白免疫小鼠制備CSFV單抗。得到2株效價(jià)1:80000的IgGI型腹水單抗2-77、4-35,稀釋800倍用于IFA試驗(yàn),可以很好地鑒別CSFV的感染。單抗的成功制備,為實(shí)驗(yàn)室鑒定CSFV及后續(xù)試驗(yàn)的開展提供了基礎(chǔ)。普通細(xì)菌載體質(zhì)粒存在將自身DNA與宿主染色體整合的潛在危險(xiǎn),微環(huán)DNA載體(Minicircle DNA Vectors)可通過(guò)位點(diǎn)特異重組酶對(duì)載體質(zhì)粒進(jìn)行切割重組,并通過(guò)宿主體內(nèi)特異性酶的作用,形成含有目的基因及表達(dá)所需原件的微環(huán)DNA質(zhì)粒,縮短了載體質(zhì)粒片段長(zhǎng)度,減小了整合的潛在危險(xiǎn)。本試驗(yàn)根據(jù)分離毒株SDWF 2016基因組序列,構(gòu)建豬瘟病毒E2基因去跨膜區(qū)(dTMR)的微環(huán)DNA載體質(zhì)粒pMC-E2d-PP、pMC-E2d-MC,用其對(duì)小鼠進(jìn)行免疫,分析其體液免疫水平和細(xì)胞免疫水平。結(jié)果顯示在免疫后第5周,試驗(yàn)組pMC-E2d-MC抗體水平呈現(xiàn)陽(yáng)性,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CSFV特異性CD8+T細(xì)胞,及細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4 增值率分別為 10.67%,1.98%,0.722%,表明 CSFV 微環(huán) DNA 質(zhì)粒可以引起體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。本研究為CSFV新型疫苗的研發(fā)提供了新思路和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.651
【部分圖文】：

圖１．１?ＣＳＦＶ粒子和基因組結(jié)構(gòu)示意圖（Ｂｅｅｒ?，?２００７）??１．１．２．１?ＣＳＦＶ結(jié)構(gòu)蛋白及其功能??核衣殼蛋白Ｃ（Ｃｏｒｅ），其Ｎ端１６９Ｓｅｒ是蛋白水解酶Ｎｐｒｏ的作用位點(diǎn)，通２６７Ａｌａ信號(hào)肽酶（ＳＰ）的作用位點(diǎn)與糖蛋白Ｅ０連接。成熟的Ｃ蛋白由９９個(gè)氨酸殘基組成，含Ｌｓｙ和Ａｒｇ等堿性氨基酸比例較高，其大小約為１４?ｋＤａ（ＭｅｙｅｒＳ?，１９８９；?Ｔｈｉｅｌ?，?１９９１?；Ｈｅｉｍａｎｎ?，?２００６）。有研究表明它對(duì)病毒復(fù)制過(guò)程中病毒基因ＲＮＡ結(jié)構(gòu)重排、包裝和病毒粒子形態(tài)形成和感染發(fā)揮作用（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，?１９９６Ｉｖａｎｙｉ，２００８）。??囊膜糖蛋白Ｅ０?（Ｅｍｓ）是ＣＳＦＶ編碼的蛋白中結(jié)構(gòu)和功能都比較獨(dú)特的一個(gè)白，具有ＲＮａｓｅ活性，因此又稱Ｅｍｓ。它能夠經(jīng)過(guò)多步ＲＮＡ多核苷酸基質(zhì)的合、裂解過(guò)程，產(chǎn)生線性３’單核苷酸（Ｋｒｅｙｅｔａｌ．，２０１２）。Ｅ０蛋白通過(guò)Ｎ端２６８ｇｉｕ與Ｃｏｒｅ相連，通過(guò)４９４Ａｉａ與Ｅｌ蛋白相連，共有ａａ殘基２２７個(gè)，其大小約４４－４８ｋＤａ。成熟的Ｅ０蛋白是以由二硫鍵連接而成的同源二聚體形式（Ｒｉｉｍｅｎａｐｆ，

通過(guò)位點(diǎn)特異重組酶在普通質(zhì)粒體內(nèi)表達(dá)，對(duì)ａｔｔＢ和ａｔｔＰ重組位點(diǎn)??進(jìn)行識(shí)別，介導(dǎo)發(fā)生重組，得到只含有目的基因表達(dá)所必須的表達(dá)框的微環(huán)ＤＮＡ??載體（圖１．３），縮短了載體片段長(zhǎng)度，降低不利效應(yīng)發(fā)生的概率。??＾ｉｎｉｄｒｃｌｅ＾??ＭＬ?｜＾Ｐｌｗｎｏｔｏｆ?．?ｂ?雜潑微奶??一?＞：—??（ｗｎｉＫＨｎ?０Ｘ４Ｘ３１?Ｉｍｅｖｃａｅ??Ｍｒｔ?Ｓ（＊－ｌ?ｔｎｄｏｎｕｃｕｗｓ＊?ｑ＾＞％）??、?Ｋ?２?ｄａｙｓ?８ｄａＶｓ??游？戀１邏??Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ??圖１．３：微環(huán)ＤＮＡ形成及持續(xù)表達(dá)示意圖（Ｓｙｓｔｅｍ?Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，?Ｉｎｃ；２０１０）??研究表明在ＰＢＡＤ／ａｒａ?Ｃ阿拉伯糖系統(tǒng)內(nèi)，在無(wú)誘導(dǎo)狀態(tài)下重組酶的表達(dá)會(huì)??被抑制，將含有目的基因的重組親本質(zhì)粒（Ｐａｒｅｎｔａｌ?Ｐｌａｓｍｉｄ；ＰＰ）轉(zhuǎn)入特定能同時(shí)產(chǎn)??生重組酶和Ｓｅｅｌ核酸內(nèi)切酶的大腸桿菌（Ｋａｙ?ｅｔａｌ．，２０１０）中，使其進(jìn)行克隆擴(kuò)增，??再用阿拉伯糖對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)，使重組酶發(fā)揮作用，對(duì)ＰＰ質(zhì)粒進(jìn)行切割重組，形??成含有目的基因和表達(dá)原件的重組微環(huán)質(zhì)粒（Ｍｉｎｉｃｉｃｒｙ?；ＭＣ）和細(xì)菌骨架??（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ?Ｂａｃｋｂｏｎｅ?；ＢＢ）?ＤＮＡ。細(xì)菌骨架含有Ｓｅｅｌ核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，在宿主大??腸桿菌表達(dá)的Ｓｅｅｌ核酸內(nèi)切酶的作用下被線性化；而含有目的基因沒(méi)有Ｓｅｅｌ核??酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的微環(huán)ＤＮＡ得以保留下來(lái)。近些年，人們也研宄出來(lái)了無(wú)需特定??菌種

為陰性對(duì)照，１－６送檢偉品，其中１、２、３、６為陽(yáng)性吉果；４、；＞為陰性結(jié)果。??本試驗(yàn)檢測(cè)了?２０１６年１月到２０１７年１２月期間送檢疑似豬瘟感染樣品，按季??度對(duì)送檢樣品和陽(yáng)性樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，顯示如下圖２－２。??〇??（Ｄ?ｍ?－３＊?ｄｉ?丨??§?．?士?ＲｉｈＨＡ??ｉｉ／??Ｉ?－??〇?ｒ?，?ｔ－ｒ￣ｔ?ｔ￣￣￣？?—＜?■??ｉ?？＂；」ｆ＇ｉ?：ｊｆ＂ｊ?：ｆ＂ｉ?Ｉ?ｉｆ＂；?：ｆ＂；?ｓｆｉｔ?．ｉｆ乂｜??２０１６?年?一｜—?２０１７年?一｜??：．」??：－＇ｉ６?１?：：．ｒ???Ｖｌ＇＂?？—，ａ?．＃二ｓ＊?ｔ．Ｅ＇ｉｓｔ?ｊ?．ｙ．ｓ￥ｇ?｜?￥－ｉ，ｔ?ｓ二％ｉｔ，ｔ?ｙ．ａ？ａ?｜??ｉ？？ｆｉ?ｌｉ?５６Ｓ?：：ｉ?ｊ?：Ａ１?１３０１?ｌｉｉ￣＂？７?ＵＳ??＾ＢＨｉＳ?］〇?：－ｉ〇?１３?ｊ?１０?｜?：ｊ?；６?Ｊ?１３＿??圖２－２?：?ＣＳＦＶ２０１６－２０１＿年抗原檢測(cè)樣本及陽(yáng)性樣本數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖??Ｆｉｇ２－２?：?Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ?ｏｆ?ＣＳＦＶ?ａｎｔｉｇｅｎ?ｔｅｓｔ?ｏｎ?２０１６－２０１７??２０１６年第１季度檢測(cè)樣品２３６份，陽(yáng)性樣本數(shù)為１０份，陽(yáng)性率為４．２４％；??第２季度檢測(cè)樣品５６８份，陽(yáng)性樣本數(shù)為９０份，陽(yáng)性率為１５．８５％；第３季度檢??測(cè)樣品２２１份，陽(yáng)性樣本數(shù)為１０份，陽(yáng)性率為４．５２％；第４季度檢測(cè)樣品２４７??份，陽(yáng)性樣本數(shù)為１０份，陽(yáng)性率為４．０５％。??２０１７年第１季度檢測(cè)樣品３０１份，陽(yáng)性樣本數(shù)為２４份，陽(yáng)性率為７．９７％；??第２季度檢測(cè)樣品２３８份
【參考文獻(xiàn)】

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1 王琴;;豬瘟病毒流行病學(xué)、病原致病特性及豬瘟綜合防制研究[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào);2006年05期

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3 余興龍,涂長(zhǎng)春,李紅衛(wèi),陳創(chuàng)夫,李作生,馬正海,孫明,殷震;豬瘟病毒E2基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及基因疫苗的研究[J];中國(guó)病毒學(xué);2000年03期

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1 曹志;豬瘟病毒及其非結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)豬巨噬細(xì)胞Toll樣受體介導(dǎo)天然免疫應(yīng)答的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2888642