抗菌藥物是人類和動物對抗細菌感染最重要的武器,然而由于抗菌藥物的大量不合理使用,細菌耐藥性問題已成為21世紀全球公共衛(wèi)生和食品安全最大的威脅之一。在過去的幾十年,新型抗菌藥物的研發(fā)速度遲緩,而細菌的耐藥性卻不斷出現(xiàn)。多粘菌素是治療多重耐藥革蘭氏陰性菌感染的“最后一道防線”,由于可轉(zhuǎn)移的多粘菌素耐藥基因mcr-1的發(fā)現(xiàn),使得多粘菌素耐藥性問題引起世界范圍的廣泛關(guān)注。目前,雖然有我國部分地區(qū)動物源大腸桿菌mcr-1耐藥基因流行情況的研究報道,但對mcr-1在我國的流行特征和傳播機制仍缺乏了解。本研究擬在調(diào)查我國東北地區(qū)動物源大腸桿菌中mcr-1流行情況的基礎(chǔ)上,進一步闡明mcr-1基因在動物源大腸桿菌中的傳播機制。本研究分析了2016年6月至2016年9月從東北三省分離的豬源、雞源和奶牛源大腸桿菌mcr-1的攜帶和流行情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞源和豬源大腸桿菌的mcr-1攜帶率明顯高于奶牛源大腸桿菌的攜帶率,并顯示絕大多數(shù)mcr-1陽性分離菌對多種抗生素耐藥,特別是對四環(huán)素、氟苯尼考和環(huán)丙沙星,多重耐藥性十分嚴峻。利用兩種分子分型方法探討了mcr-1陽性分離菌的分子流行特點,結(jié)果顯示mcr-1陽性分離菌的PFGE譜型和MLST序列型具有顯著的多樣性,菌株間的親緣關(guān)系較遠。分析了mcr-1在分離菌中的定位情況、接合轉(zhuǎn)移能力、接合轉(zhuǎn)移頻率以及質(zhì)粒穩(wěn)定性,結(jié)果顯示,mcr-1基因在質(zhì)粒和染色體上均有分布,但主要定位于大小不等的質(zhì)粒上,質(zhì)粒大小在~30kb至~430kb之間,質(zhì)粒分型結(jié)果發(fā)現(xiàn)五種不同類型的mcr-1陽性質(zhì)粒,其中以IncX4型、IncI2型和IncHI2型三種質(zhì)粒為主,接合轉(zhuǎn)移頻率范圍在1.4×10~(-6)-8.8×10~(-2)之間,穩(wěn)定性試驗表明五種不同類型的質(zhì)粒均能穩(wěn)定存在于受體菌中。通過對分離菌基因組草圖和代表性質(zhì)粒全序列進行測定,結(jié)果顯示本研究五種代表性質(zhì)粒與國內(nèi)報道的相應(yīng)類型質(zhì)粒序列具有較高的同源性,表明這些質(zhì)粒已在我國多個地區(qū)流行。同時,通過全基因組測序分析首次發(fā)現(xiàn)了攜帶mcr-1的毒力—耐藥雜合質(zhì)粒,推測其可能是由IncHI2型耐藥質(zhì)粒與IncF型毒力質(zhì)粒通過同源重組的方式融合而成。此外,對mcr-1基因環(huán)境研究發(fā)現(xiàn),Tn6330轉(zhuǎn)座子是介導mcr-1基因在不同類型質(zhì)粒間以及染色體上傳播的主要方式。對分離株中mcr-1基因序列對比發(fā)現(xiàn)兩個新的mcr-1突變體,功能研究顯示突變沒有改變MCR-1蛋白的催化活性,表明突變的兩個位點不是決定其功能的關(guān)鍵氨基酸殘基。本研究為揭示mcr-1在動物源大腸桿菌中的傳播機制,為多粘菌素耐藥菌及耐藥基因轉(zhuǎn)移擴散的風險評估和防控提供科學依據(jù)。
【學位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

.1 多粘菌素的結(jié)構(gòu)多粘菌素（Polymyxin）是一組從多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）培養(yǎng)液中提肽類抗生素，其中包含多粘菌素 A、B、C、D、E 5 種組分。迄今為止，只有多粘菌素 B菌素 E（又稱粘桿菌素）應(yīng)用于臨床。多粘菌素類抗生素發(fā)現(xiàn)于 1949 年，在日本首次分，1959 年開始在歐洲、美國和中國等國家廣泛應(yīng)用于醫(yī)學臨床和畜牧業(yè)。但由于多粘菌素窄且對腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)有較大的毒性作用，同時由于新一代療效好、毒性低的廣譜抗生素代頭孢菌素）的問世，限制了多粘菌素類藥物在人醫(yī)臨床上的使用(Li et al., 2006)。直到上 年代，隨著多重耐藥（Muti-drug resistance，MDR）和泛耐藥（Pan-drug resistance，PDR氏陰性菌，特別是耐碳青霉烯腸桿菌的出現(xiàn)，在缺乏新抗菌藥物的情況下，人們不得不重多粘菌素類藥物，將其作為治療多重耐藥革蘭氏陰性菌感染的 最后一道防線 (Falagas11)。多粘菌素屬于陽離子多肽類抗生素，非核糖體合成，其結(jié)構(gòu)是由線性的三肽部分連接肪�；満铜h(huán)狀7肽構(gòu)成，4-位的L-α,γ-二氨基丁酸殘基（L-α,γ-diaminobutyric acid，L-D 10 位的 L-蘇氨酸（Thr）縮合后形成七肽環(huán)。多粘菌素 B 與多粘菌素 E 基本結(jié)構(gòu)相同，于 7 肽環(huán)上的 6-位氨基酸不同。多粘菌素 B 的 6-位氨基酸是 D-Phe，多粘菌素 E 的 6-位氨 D-Leu（圖 1.1）。

國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第一章其它的家族成員一樣具有相似的抗菌機制。盡管詳細的多粘菌素抗菌機理還不十分清楚認為造成細胞膜裂解是其中重要的途徑之一。多粘菌素的抗菌機制與其兩個特殊的結(jié)構(gòu)：（a）一個由 7 個氨基酸殘基組成的親水性環(huán)狀多肽 頭部 ，（b）一個長的疏水性脂 ，通過三個氨基酸殘基從 頭部 延伸出來。組成多粘菌素的十個氨基酸中六個是 L氨基丁酸殘基（L-DAB），它們都集中于親水性 頭部 ，在生理 pH 條件下，可以提電荷。多粘菌素的作用靶點是革蘭氏陰性菌細胞外膜上的脂多糖（Lipopolysaccharide，L多糖 （LPS）主要包括核心多糖、O-抗原和類脂 A（LipidA），其中 Lipid A 通過結(jié)合和 O-抗原以保持細胞外膜的完整性。多粘菌素發(fā)揮抗菌活性的主要驅(qū)動力是多粘菌素膜之間的相互作用，即多粘菌素帶正電荷的陽離子 頭部 與 Lipid A 帶負電荷的陰離團之間的靜電吸引作用。一旦與 Lipid A 結(jié)合，多粘菌素的脂類 尾部 就會穿透細胞致細胞外膜結(jié)構(gòu)紊亂，增加細胞膜的通透性，進而破壞細胞膜的物理完整性，使細胞膜失衡，造成細胞內(nèi)重要成分丟失，最終導致細菌裂解和死亡（圖 1.2）。

圖 1.3 雙組分系統(tǒng)介導的多粘菌素耐藥示意圖(Baron et al., 2016)Fig. 1.3 Two-component system-mediated polymyxin resistance1 基因的發(fā)現(xiàn)究認為，多粘菌素耐藥的產(chǎn)生是由細菌染色體突變所介導的，因此無法通素耐藥，因而多粘菌素耐藥菌不易形成廣泛性流行。2007 年華南農(nóng)業(yè)大學
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