流感病毒屬于正黏病毒科,是引起哺乳動物、家禽疾病和死亡的重要病原之一。根據流感病毒NP蛋白和M蛋白的抗原差異,可以將其分為A型、B型、C型以及D型流感病毒。A型流感病毒除感染人外還能感染其它動物,如禽、馬、豬、海豹等,B型和C型主要感染人,而D型流感病毒僅有部分牛感染病例。A型流感病毒的自然宿主是水禽,同時其對人和哺乳動物也具有較大危害,A型流感病毒經常以流行的形式出現,甚至引起流感大流行,給全球經濟以及公共衛(wèi)生安全造成了極大的威脅。疫苗免疫仍是防治流感病毒感染最有效的措施,但是由于流感病毒HA蛋白易于發(fā)生突變,使得每1-3年就需要更新疫苗株,給流感病毒的疫苗研制與使用推廣帶來極大的障礙。為此深入研究流感病毒的復制周期,對尋找新的保守的抗流感病毒靶標,進而研制新的抗流感病毒藥物具有重要意義。本實驗室利用siRNA全基因組文庫篩選影響流感病毒復制的宿主因子,獲得宿主因子——包含DENN結構域蛋白1B(DENN Domain-containing protein 1B,DENND1B),在此基礎上,通過siRNA干擾和CRISPR Cas9系統(tǒng)驗證siRNA篩選結果,并通過慢病毒介導的過表達系統(tǒng)以及逆轉錄病毒介導的過表達系統(tǒng),驗證了宿主因子DENND1B正調控流感病毒的復制,進一步研究發(fā)現宿主因子DENND1B調控病毒復制的關鍵區(qū)域是N端結構域。同時,我們研究發(fā)現宿主因子DENND1B能夠與流感病毒PB1蛋白以及PA蛋白相互作用,其作用的關鍵區(qū)域是DENND1B的C端結構域。深入研究結果表明,流感病毒感染誘導AP2B1亞細胞定位改變,DENND1B能夠調控AP2B1蛋白的表達以及細胞定位。此外,上調宿主因子DENND1B表達后,能夠加速病毒感染早期AP2B1、DENND1B以及NP蛋白指示的流感病毒向細胞膜的聚集以及共定位,表明宿主因子DENND1B主要通過影響內吞環(huán)節(jié)來影響流感病毒復制。本研究初步揭示了宿主因子DENND1B調控流感病毒感染后內吞環(huán)節(jié)的分子機制,豐富了宿主因子與病毒蛋白互作網絡,深化了對流感病毒復制周期的理解。
【學位單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

國農業(yè)科學院碩士論文 第二章 宿主因子 DENND1B 正調控流感病毒的復制.3 實驗結果.3.1 DENND1B 下調效果檢測我們分別將 Scrambled siRNA、siRNA-1、siRNA-2 以及 siRNA-3 轉染 A549 細胞，48 h 后收細胞提取 RNA，反轉錄后進行 qPCR 檢測。經分析三條 siRNA 均能下調 DENND1B 基因的轉水平，siRNA-1、siRNA-2 以及 siRNA-3 分別下調 DENND1B 基因轉錄水平 89%、44%、53%，iRNA-1 下調 DENND1B 基因表達效果最明顯(圖 2.1)。同時我們利用 CRISPR Cas9 構建ENND1B 的敲除細胞系，將 DENND1B 外顯子區(qū)域敲除后，經驗證成功敲除 DENND1B 基因(圖.2)。

將 DENND1B 外顯子區(qū)域敲除后，經驗證成功敲除 DENND1B 基因(圖2.2)。2.3.2 下調 DENND1B 抑制流感病毒復制根據 DENND1B 干擾下調結果顯示，DENND1B siRNA-1 下調 DENND1B 轉錄水平最明顯，所以我們選擇 siRNA-1 進行后續(xù)實驗。通過 siRNA 干擾后感染 WSN 流感病毒，我們發(fā)現干擾圖 2.1 熒光定量 PCR 檢測 DENND1B 基因 siRNA 干擾效果Fig. 2.1 siRNA knockdown of DENND1Bdetected by qPCR in A549 cells圖 2.2 熒光定量 PCR 檢測 DENND1B基因敲除效果Fig. 2.2 The expresion of DENND1B detectedby qPCR in Ko_DENND1B cells圖 2.3 siRNA 干擾下調 DENND1B 表達抑制流感病毒復制Fig. 2.3 siRNA knockdown of DENND1Bdecreases IAV replication.圖 2.4 敲除下調 DENND1B 表達抑制流感病毒復制Fig. 2.4 Knockout of DENND1Bby CRISPR Cas9 decreases IAV replication.

.2 下調 DENND1B 抑制流感病毒復制根據 DENND1B 干擾下調結果顯示，DENND1B siRNA-1 下調 DENND1B 轉錄水平最明顯，我們選擇 siRNA-1 進行后續(xù)實驗。通過 siRNA 干擾后感染 WSN 流感病毒，我們發(fā)現干擾圖 2.1 熒光定量 PCR 檢測 DENND1B 基因 siRNA 干擾效果Fig. 2.1 siRNA knockdown of DENND1Bdetected by qPCR in A549 cells圖 2.2 熒光定量 PCR 檢測 DENND1B基因敲除效果Fig. 2.2 The expresion of DENND1B detectedby qPCR in Ko_DENND1B cells
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本文編號：2887995