作為Krüppel樣轉錄因子(Krüppel-like factors,KLF)家族成員之一,KLF10具有三個高度保守的Cys2/His2鋅指結構,調控著細胞的很多功能。最近有學者在小鼠3T3-L1細胞系中發(fā)現KLF10與脂肪細胞分化有關。但在反芻動物尤其是山羊(Capra hircus)上尚未見到相關報道,本實驗室前期轉錄組測序結果表明KLF10可能參加山羊肌內脂肪細胞分化。因此本研究以簡州大耳羊為試驗動物,利用細胞培養(yǎng)、實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)、Western Blot、過表達、RNA干擾和雙熒光素酶報告實驗等方法在克隆獲得山羊KLF10基因序列的基礎上,明確了KLF10對山羊肌內前體脂肪細胞分化的調控作用及闡明了其可能的作用機制。主要獲得以下研究成果:(1)成功克隆獲得山羊KLF10基因序列1457 bp,包括完整的CDS區(qū)1449bp,編碼482個氨基酸;篩選并確定了TBP為山羊組織器官中表達最穩(wěn)定的內參基因,組織表達結果顯示KLF10在山羊各組織中存在廣泛表達,且在脾和肺中表達水平最高(P0.01)。(2)在山羊肌內前體脂肪細胞分化過程中,KLF10表達水平總體呈上升趨勢;過表達KLF10極顯著增加了肌內脂肪細胞中脂滴的積聚;過表達KLF10脂肪細胞分化標志基因C/EBPα表達水平顯著上調(P0.05),LPL和C/EBPβ表達水平顯著下調(P0.05),SREBP1表達水平極顯著下調(P0.01);過表達KLF10后KLF3、KLF14和KLF17的mRNA表達量極顯著上調(P0.01),KLF1和KLF16的mRNA的表達量也被顯著上調(P0.05),而KLF11的表達水平則顯著下調(P0.05)。(3)干擾KLF10后極顯著降低了山羊肌內脂肪細胞中脂滴的積聚;同時干擾KLF10后LPL、AP2、C/EBPα和SREBP1表達水平極顯著下調(P0.01),而Pref-1表達水平則被極顯著上調(P0.01);KLF1、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF11、KLF12、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17的mRNA表達量均受到抑制極顯著降低(P0.01),而KLF3的表達水平則顯著上調(P0.05)。(4)成功克隆得到山羊C/EBPα啟動子序列并構建其熒光素酶報告載體,轉染至山羊肌內前體脂肪細胞后,檢測結果顯示KLF10過表達后C/EBPα啟動子活性顯著增強(P0.01)。綜上所述,本研究克隆獲得了山羊KLF10基因序列,并明確了其組織與細胞時序表達特性,綜合過表達和干擾結果發(fā)現KLF10促進山羊肌內前體脂肪細胞分化,并且這種調控作用可能是協同該家族部分成員通過C/EBPα來實現的。
【學位單位】：西南民族大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S827
【部分圖文】：

該家族有三個亞型：PPARα、PPARδ 和 PPARγ。其中 PPARγ 主要在脂肪組織中表達，是決定脂肪細胞末端分化的關鍵轉錄因子，研究表明在 PPARγ 缺失的情況下脂肪分化將無法進行（Kim et al., 2001）。當 PPARγ 過表達后可以促使其他細胞轉化為脂肪細胞，Yu 等對豬的 PPARγ 基因過表達后發(fā)現 C2C12 成肌細胞轉化為脂肪細胞（Yu et al., 2006）。研究表明許多轉錄因子在調控脂肪細胞分化期間是通過促進或者抑制 PPARγ 基因表達發(fā)揮作用的，PPARγ 和 TLE3 能夠協同發(fā)揮作用促進脂肪生成（Villanueva et al., 2011）。還有 C/EBP 家族、GATA2（GATA binding protein 2）和 GATA3（GA-TA binding protein 3）等均通過調控PPARγ 發(fā)揮調控脂肪細胞分化的作用（圖 1-1）。

圖 1-2 KLF 異構體的轉錄調節(jié)因子 引自 Pollak et al., 2018Fig.1-2 Transcriptional Coregulators of KLF Isoforms Cited from Pollak et al., 2018KLFs 家族成員可以調節(jié)哺乳動物多種生物過程，包括細胞增殖、凋亡、分組織胚胎發(fā)育以及維持機體和組織的穩(wěn)態(tài)。近年廣泛通過體內和體外試驗研現多個 KLFs 家族成員參與脂肪細胞分化調控（圖 1-3）。KLF2-KLF9、KLF13KLF15 已經被正式確認在脂肪細胞分化過程中發(fā)揮重要的作用，其中 KLF4、5、KLF6、KLF8、KLF9、KLF13 和 KLF15 可以促進脂肪細胞分化，KLF2、

圖 1-2 KLF 異構體的轉錄調節(jié)因子 引自 Pollak et al., 2018Fig.1-2 Transcriptional Coregulators of KLF Isoforms Cited from Pollak et al., 2018KLFs 家族成員可以調節(jié)哺乳動物多種生物過程，包括細胞增殖、凋亡、分化、組織胚胎發(fā)育以及維持機體和組織的穩(wěn)態(tài)。近年廣泛通過體內和體外試驗研究發(fā)現多個 KLFs 家族成員參與脂肪細胞分化調控（圖 1-3）。KLF2-KLF9、KLF13和 KLF15 已經被正式確認在脂肪細胞分化過程中發(fā)揮重要的作用，其中 KLF4、KLF5、KLF6、KLF8、KLF9、KLF13 和 KLF15 可以促進脂肪細胞分化，KLF2、KLF3 和 KLF7 則起到抑制脂肪細胞分化的作用。
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本文編號：2883586