豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是引起豬圓環(huán)病毒病(PCVD)的主要病原,引起豬的免疫抑制并能與其它病原微生物繼發(fā)感染,給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。Cap蛋白是其主要的開放閱讀框ORF2編碼的,是PCV2的免疫原性蛋白及主要的結(jié)構(gòu)蛋白,在流行病學診斷及疫苗學研究中起著至關(guān)重要的作用。細菌鞭毛蛋白是TLR5的唯一配體,創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB具有良好的分子佐劑作用。ELK16自聚肽融合標簽?zāi)茉诰w內(nèi)形成類包涵體,其融合蛋白可用離心洗滌法純化。本研究利用生物信息學軟件,將FlaB、PCV2 Cap基因序列優(yōu)化成大腸桿菌偏愛密碼子序列,將合成序列克隆入自聚肽ELK16融合表達載體pET-ELK16,將重組載體 pELK16-FlaB-Cap、pELK16-FlaB 和 pELK16-Cap 轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)大腸桿菌,用IPTG誘導融合蛋白表達。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示,三種融合蛋白均以類包涵體表達,經(jīng)0.5%Triton X-100離心洗滌后,ELK16-FlaB-Cap融合蛋白的純度達90%,產(chǎn)量達92mg/L;ELK16-FlaB融合蛋白的純度達96%,產(chǎn)量達105mg/L;ELK16-Cap融合蛋白的純度達93%,產(chǎn)量達92mg/L。分別用ELK16-Cap + IFA(弗氏不完全佐劑)、ELK16-Cap + ELK16-FlaB 和 ELK16-FlaB-Cap 免疫小鼠,初免后 7、14、21 和 28 天采血,用間接ELISA進行抗體檢測,結(jié)果顯示初免后7天,三個免疫組即為ELISA抗體檢測陽性,隨后抗體水平呈逐漸上升趨勢,其中ELK16-Cap+ELK16-FlaB免疫組的抗體水平最高,IFA + ELK16-Cap免疫組次之,ELK16-FlaB-Cap免疫組抗體水平最低。二免后14天取小鼠脾臟淋巴細胞,分別用ConA(5μg/mL)和Cap(10μg/mL)刺激,用試劑盒檢測細胞因子表達。結(jié)果與對照組相比,免疫組的TNF-α、IL-12和IFN-y表達水平明顯上升,其中Cap刺激組TNF-α顯著高于ConA刺激組,兩組IL-12和IFN-y水平相當。這些研究結(jié)果表明,ELK16-FlaB對PCV2 Cap蛋白ELISA抗體產(chǎn)生的具有刺激作用顯,ELK16-FlaB-Cap的刺激作用相對較弱;ELK16-FlaB-Cap對刺激IL-12產(chǎn)生的作用較強,ELK16-FlaB對刺激TNF-α和IFN-y產(chǎn)生的作用較強。為了優(yōu)化PCV2重組亞單位疫苗和比較純化標簽對FlaB免疫刺激作用的影響,將PCV-2a、PCV-2d、PCV-2e中和抗原表位與PCV-2bCap基因串聯(lián),與His標簽融合表達,并將His標簽與FlaB基因進行表達融合,利用親和層析純化融合蛋白。再將FlaB基因與ELP(類彈性蛋白多肽)進行融合表達,利用相變循環(huán)純化重組蛋白。將36只小鼠分為6組,分別為 PBS 對照組、His-4Cap 免疫組、His-4Cap + ELP-FlaB 免疫組、His-4Cap + His-FlaB免疫組、His-4Cap + ELK16-FlaB免疫組和His-4Cap + IFA免疫組。初免后7、14、21和28天采血,用間接ELISA測定Cap蛋白特異抗體;二免后14天取小鼠脾臟淋巴細胞,用ConA或His-4Cap刺激后檢測細胞因子表達。二免后14天,每組3只小鼠用103個TCID50 PCV2攻毒,攻毒后3天和7天取小鼠血清進行病毒血癥檢測。結(jié)果在初免后第7天,His-4Cap + ELP-FlaB即為ELISA抗體檢測陽性,其他四組為抗體檢測陰性;從初免后14天,抗體水平呈上升趨勢;在初免后21天,4個免疫組的抗體水平明顯上升,其中His-4Cap+ His-FlaB免疫組的抗體水平最高。與對照組相比,五個免疫組的TNF-α、IL-12和IFN-y表達水平明顯上升,His-4Cap刺激組的TNF-α水平高于ConA刺激組IL-12和IFN-y水平相當。這些研究結(jié)果表明,His、ELP和ELK16標簽對FlaB刺激PCV2重組Cap蛋白ELISA抗體產(chǎn)生無明顯影響,三種標簽融合表達的FlaB均能刺激小鼠產(chǎn)生TNF-α、IL-12和IFN-γ表達,其中ELK16-FlaB的刺激作用較強。5個免疫組的小鼠血清病毒載量均下降,His-4Cap+ELP-FlaB免疫組的病毒載量最低。
【學位單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S852.4
【部分圖文】：

圖１－丨融合表迗載體的結(jié)構(gòu)示意圖??Ｆｉｇｌ－１?：?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｆｕｓｉｏｎ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒ??１．５．１基因合成??用網(wǎng)上在線軟件ＪＡＶＡＣｏｄｏｎＡｄａｐｔｉｏｎＴｏｏｌ，將ＦｌａＢ和Ｃａｐ編碼序列（Ｋ１２株）偏愛密碼子序列，序列在南京金斯瑞生物公司合成，克隆在ｐＵＣ１．５．２質(zhì)粒提取??將ｐＵＣ５７－ＦｌａＢ和ｐＵＣ５７－Ｃａｐ重組菌按１：１００比例接種含１００Ｕ／ｍＬ氨液體培養(yǎng)基？，將ＰＥＬＫ１６菌株按１：１００比例接種含ＳＯｐｇ／ｍＬ卡那霉素的ＬＢ液培養(yǎng)過夜，分別收集菌體提取質(zhì)粒，方法如下：??�。担恚膛囵B(yǎng)過夜的菌液，１２０００ｇ離心ｌｍｉｎ，棄上清，收集菌體；加Ｓ１?（含ＲＮａｓｅ?Ａ）重懸細菌沉淀，重懸均勻；加入２５０?ｐＬ?Ｂｕｆｆｅｒ?Ｓ２，上下體充分裂解，應(yīng)在５ｍｉｎ內(nèi)完成；加入３５０?｜ｉＬ?Ｂｕｆｆｅｒ?Ｓ３，上下翻轉(zhuǎn)混合６？８

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?分析，結(jié)果顯示：ＩＰＴＧ?誘導的?ｐＥＬＫ１６－ＦｌａＢ、ｐＥＬＫ１６－Ｃａｐ?和?ｐＥＬＫ１６－ＦＩａＢ－Ｃａｐ??重組菌分別出現(xiàn)預期的６５ＫＤａ、４７ＫＤａ和８２ＫＤａ額外蛋白條帶，表達產(chǎn)物以類包涵體存??在于裂解菌體的沉淀中（圖１－３、圖１－４和圖１－５）。??

Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ；?ｌ：ＥＬＫ１６－ＦｌａＢ；?２：ＥＬＫ１６－Ｃａｐ；??３：ＥＬＫ１６ＦｌａＢ－Ｃａｐ??圖１－２表達載體的酶切鑒定??Ｆｉｇ．?１－２?Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｏｆ?ｆｕｓｉｏｎ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒｓ??２．２融合蛋白表達分析??２．２．１?３７°Ｃ誘導表達??將?ｐＥＬＫ１６－ＦｌａＢ、ｐＥＬＫ１６－Ｃａｐ?和?ｐＥＬＫ１６－ＦｌａＢ－Ｃａｐ?重組菌用?０．２?ｍＭ?ＩＰＴＧ?在?３７°Ｃ誘??導表達６ｈ后，離心收集沉淀菌體，經(jīng)超聲波裂解后離心，分別取離心上清和沉淀進行??ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?分析，結(jié)果顯示：ＩＰＴＧ?誘導的?ｐＥＬＫ１６－ＦｌａＢ、ｐＥＬＫ１６－Ｃａｐ?和?ｐＥＬＫ１６－ＦＩａＢ－Ｃａｐ??重組菌分別出現(xiàn)預期的６５ＫＤａ、４７ＫＤａ和８２ＫＤａ額外蛋白條帶，表達產(chǎn)物以類包涵體存??在于裂解菌體的沉淀中（圖１－３、圖１－４和圖１－５）。??
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本文編號：2883319