禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)是引發(fā)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥(RE)的病原。RE是一種對禽類危害嚴重的腫瘤病和免疫抑制病,與馬立克病(MD)和禽白血病(AL)并稱為三種危害禽類的病毒性腫瘤病。在宿主與病原相互作用過程中miRNA起著重要的作用,大多數(shù)miRNA基因位于與腫瘤形成密切相關的脆弱基因位點,在腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個環(huán)節(jié)中發(fā)揮著類似腫瘤癌基因或抑癌基因的關鍵性作用,研究并分析REV感染細胞內(nèi)源性miRNA對進一步揭示REV致病的分子機理、發(fā)掘細胞抗REV分子靶標具有重要的理論意義與應用前景。鑒于此,本研究利用SPF雞人工感染模型,選擇脾臟組織作為研究對象,因為脾臟是雞重要的外周免疫器官,是成熟T、B淋巴細胞的定居和免疫應答場所。采用高通量測序技術以及qRT-PCR檢測方法,通過鑒定免疫致病相關的主要差異mRNA和miRNA,初步探討了REV與雞體在miRNA調(diào)控水平上的相互作用。主要研究內(nèi)容如下:1.本研究使用REV-SNV標準株腹腔注射1日齡SPF雛雞。分別在7、14、21、28、35和42dpi采集三種主要的免疫器官(脾臟、胸腺和法氏囊),觀察臨診癥狀、記錄眼觀病變并計算免疫器官指數(shù)。結(jié)果表明,REV感染SPF雞后,與對照組相比,感染組雛雞出現(xiàn)精神萎靡,羽毛凌亂且稀少,食欲減退,體重減輕等癥狀。剖檢見法氏囊和胸腺萎縮、脾臟腫大,同時法氏囊和胸腺指數(shù)下降、脾臟指數(shù)升高。2.根據(jù)REV的gag基因保守序列設計一條特異性探針及引物,建立了TaqMan探針qRT-PCR檢測方法。結(jié)果顯示標準曲線線性關系良好,線性回歸方程為Y=-3.4171X+41.92,相關系數(shù)R~2=0.9965;特異性良好,僅能檢測REV,無交叉反應現(xiàn)象;敏感性良好,最小檢出模板濃度約為10 copies/μL,是普通PCR的1000倍;重復性良好,批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于2%。應用該方法,對7、14、21、28、35和42dpi脾臟、胸腺和法氏囊的病毒載量與前病毒載量進行檢測,結(jié)果表明,在每個時間點均能檢測到病毒RNA與前病毒DNA。脾臟、胸腺和法氏囊(前)病毒載量整體趨勢一致,均在28dpi檢測到最低的(前)病毒載量。除法氏囊在21dpi檢測到最高的(前)病毒載量外,脾臟和胸腺均在14dpi檢測到最高的(前)病毒載量。3.選取7、14和21dpi的脾臟組織樣品,利用高通量測序技術對兩組樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析,獲得1507個差異mRNA,其涉及先天免疫反應(TLR、MAD5、TRIM25)、適應性免疫反應(LY6E、CD36、LAG3)、凋亡與自噬(IRF1、PDCD1、WNT5A)和炎癥反應(CCL4、TNFRSF18、CDKN2)等。另外模式識別受體、T細胞受體、JAK-STAT、TNF以及NF-kappa B信號通路等在REV感染期間發(fā)揮重要作用。最后,通過qRT-PCR驗證33個免疫相關mRNA,其表達量與測序數(shù)據(jù)呈正相關,在三個時間點的相關系數(shù)分別為:R~2=0.961、0.9681和0.9467,表明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果準確、可靠。4.miRNA表達譜分析結(jié)果顯示,在7、14和21dpi共獲得63個差異miRNA(30個已知miRNA和30新型miRNA)以及7373個候選靶基因。功能富集分析結(jié)果表明,miRNA在SPF雞的不同生長階段具有重要的生物學功能并在多種類型的信號通路中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。最后,通過qRT-PCR驗證15個miRNA,其表達量與測序數(shù)據(jù)呈正相關,在三個時間點的相關系數(shù)分別為:R~2=0.9384、0.9718和0.9788,表明小RNA測序結(jié)果準確、可靠。5.miRNA與mRNA的整合分析結(jié)果顯示,在7、14和21dpi共獲得482個差異靶基因,并預測到886個已知miRNA-mRNA作用對和580個新型miRNA-mRNA作用對。功能富集分析結(jié)果顯示,差異表達靶基因顯著富集在免疫相關的信號通路類別中,如免疫系統(tǒng)、細胞生長與凋亡、信號分子和相互作用、信號轉(zhuǎn)導類別。通過qRT-PCR進一步驗證14對免疫相關miRNA-mRNA作用對。結(jié)果表明,REV感染后miRNA可以調(diào)控炎性細胞因子(CCR2、CCR4、CCR8、STAT1)發(fā)生變化,并影響T、B淋巴細胞調(diào)節(jié)因子(CTLA4、CASP10、RAPGEF4)的表達。同時,凋亡因子(FOS、JUN、TNFSF6)和腫瘤調(diào)節(jié)因子(MAPK10、TNFRSF13C)的表達也發(fā)生變化。這些結(jié)果拓寬了對REV感染引起免疫抑制和誘導腫瘤發(fā)生機制的理解,但其具體作用機制尚需進一步研究。
【學位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

山東農(nóng)業(yè)大學碩士專業(yè)學位論文.3 REV 感染 SPF 雞脾臟轉(zhuǎn)錄組的構(gòu)建測序流程7 日齡組（INF1-1、INF1-2、INF1-3、CON1-1、CON1-2、CON1-3）、14 日齡組（ININF2-2、INF2-3、CON2-1、CON2-2、CON2-3）和 21 日齡組（INF3-1、INF3-2、ININF3-4、CON1-1、CON1-2、CON1-3）共計 19 個脾臟樣品進行高通量測序。具體如圖 1 所示：

20圖 2 Tophat 分析原理Fig.2 Tophat analysis principlemRNA 表達量分析（1） 表達定量：使用 HTSeq 0.6.1p2（http://www.huber.embl.de/users/anders/HTSeq）統(tǒng)計比對到每一個基因上 Read Count值，作為基因的原始表達量。統(tǒng)計方法如圖 3 所示：首先讀取基因結(jié)構(gòu)注釋信息，然后將比對結(jié)果與基因結(jié)構(gòu)進行比較并統(tǒng)計結(jié)果。

圖 3 Read Count 統(tǒng)計模式圖Fig.3 Read Count statistical mode diagram標準化：由于不同樣品過濾后獲得的數(shù)據(jù)量不可能差異。為了能夠在樣品內(nèi)（不同基因）以及樣品間（用 RPKM（Reads Per Kilo bases per Million reads）即堿基長度的 Reads 數(shù)目對表達量進行標準化（Normal圖 4 RPKM 計算公式Fig.4 RPKM calculation formula達量的測序質(zhì)量評估：通過以下 5 種方式對測序質(zhì) RPKM 密度分布整體考察樣品的基因表達模式。2
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