豬瘟(Classical swine fever,CSF)在全世界范圍內(nèi)流行,患病豬主要表現(xiàn)為全身有出血點(diǎn)或出血斑,臟器有梗死灶,由此造成的豬只病死率高達(dá)90%,嚴(yán)重危害養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)。目前控制豬瘟的措施仍是以疫苗接種為主,豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2蛋白作為CSFV的主要保護(hù)性抗原,是新型疫苗研發(fā)的研究熱點(diǎn)。蛋白含量檢測(cè)是豬瘟病毒E2蛋白亞單位疫苗半成品質(zhì)量控制的關(guān)鍵,然而常規(guī)的蛋白定量檢測(cè)方法都是針對(duì)溶液中總蛋白的檢測(cè),無(wú)法針對(duì)目的蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確定量。為了解決這一難題,本課題利用針對(duì)CSFV E2蛋白的不同抗原表位的單克隆抗體,建立了針對(duì)CSFV E2蛋白的膠乳增強(qiáng)免疫比濁法(Latex nanoparticle-enhanced turbidimetric immunoassay,LTIA)。該方法能夠特異性檢測(cè)樣品中的目的蛋白,且簡(jiǎn)單、快速。本研究首先將實(shí)驗(yàn)室已篩選的3株CSFV E2蛋白單克隆抗體(15A9、14F12和12H12)的雜交瘤細(xì)胞株復(fù)蘇,制備腹水,通過(guò)間接免疫熒光(IFA)測(cè)定其效價(jià)。利用G蛋白親和層析法對(duì)腹水進(jìn)行純化,通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和二喹啉甲酸(BCA)法分別鑒定其純度和濃度。然后采用雙抗體夾心ELISA法初步對(duì)CSFV E2蛋白單克隆抗體進(jìn)行配對(duì)篩選,再使用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法進(jìn)行單克隆抗體配對(duì)復(fù)篩,從而確定最佳的單抗配對(duì)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為進(jìn)一步提高檢測(cè)方法的靈敏度和準(zhǔn)確性,將建立好的膠乳增強(qiáng)免疫比濁法進(jìn)行反應(yīng)條件和體系的優(yōu)化。根據(jù)上述獲得的最優(yōu)條件組裝膠乳增強(qiáng)免疫比濁法定量檢測(cè)豬瘟病毒E2蛋白試劑盒,并確定了該試劑盒的檢測(cè)線性范圍和標(biāo)準(zhǔn)曲線,驗(yàn)證了其最低檢出限、準(zhǔn)確度和精密度。最后收集CHO細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)的CSFV E2蛋白樣品,分別用SDS-PAGE、BCA法和本實(shí)驗(yàn)所建立的LTIA方法檢測(cè),并進(jìn)行方法學(xué)比較。研究結(jié)果表明,使用CSFV E2蛋白單克隆抗體12H12和15A9配對(duì)標(biāo)記膠乳微球,粒徑為150 nm的膠乳粒子以及10:1的單克隆抗體標(biāo)記比例時(shí),該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性更好。該方法的反應(yīng)體系為150μL的樣品稀釋液(R1),5μL的CSFV E2蛋白標(biāo)準(zhǔn)品,50μL的已進(jìn)行抗體標(biāo)記的膠乳粒子溶液(R2)以及200 s的反應(yīng)時(shí)間。此外,該試劑盒的檢測(cè)范圍為25μg/mL~0.5 mg/mL,回收率范圍為91%~100%,批內(nèi)變異系數(shù)小于15%,批間變異系數(shù)小于10%。該方法對(duì)未純化CSFV E2蛋白樣品的檢測(cè)結(jié)果與BCA法和SDS-PAGE法的檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)一致,滿足其對(duì)樣本的檢測(cè)要求。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.651
【文章目錄】：
摘要
Abstract
文獻(xiàn)綜述
    第一章 豬瘟病毒E2蛋白及蛋白濃度檢測(cè)方法的研究進(jìn)展
        1.1 豬瘟病毒病原學(xué)
            1.1.1 豬瘟病毒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)
            1.1.2 豬瘟病毒的基因組結(jié)構(gòu)及功能
            1.1.3 病毒編碼的結(jié)構(gòu)蛋白及其功能
            1.1.4 豬瘟病毒的入侵機(jī)制
        1.2 豬瘟的流行病學(xué)特征
        1.3 豬瘟的臨床癥狀及病理變化
        1.4 豬瘟的診斷方法
            1.4.1 流行病學(xué)調(diào)查
            1.4.2 臨床診斷和尸體剖檢
            1.4.3 實(shí)驗(yàn)室診斷
        1.5 豬瘟的防控
        1.6 重組豬瘟病毒E2蛋白的質(zhì)量控制
        1.7 常用蛋白質(zhì)定量檢測(cè)方法
        1.8 膠乳增強(qiáng)免疫比濁法的研究進(jìn)展
            1.8.1 膠乳增強(qiáng)免疫比濁法的概述
            1.8.2 膠乳增強(qiáng)免疫比濁法的分類
            1.8.3 膠乳增強(qiáng)免疫比濁法的原理
            1.8.4 膠乳微球的種類
            1.8.5 膠乳增強(qiáng)免疫比濁法的應(yīng)用
        1.9 研究目的及意義
試驗(yàn)研究
    第二章 豬瘟病毒E2蛋白膠乳增強(qiáng)免疫比濁法的建立
        2.1 材料
            2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            2.1.2 主要儀器
            2.1.3 主要試劑
            2.1.4 試劑配制
        2.2 方法
            2.2.1 CSFV E2 蛋白單克隆抗體制備
            2.2.2 雙抗體夾心ELISA初步篩選單抗配對(duì)
            2.2.3 膠乳增強(qiáng)免疫比濁法的建立
            2.2.4 膠乳增強(qiáng)免疫比濁法單抗配對(duì)復(fù)篩
            2.2.5 微球粒徑的優(yōu)化
            2.2.6 抗體標(biāo)記比例的優(yōu)化
            2.2.7 樣品稀釋液（R1）的優(yōu)化
            2.2.8 反應(yīng)體系的優(yōu)化
        2.3 結(jié)果
            2.3.1 CSFV E2 蛋白單抗腹水效價(jià)測(cè)定
            2.3.2 CSFV E2 蛋白單克隆抗體純度鑒定
            2.3.3 CSFV E2 蛋白單克隆抗體濃度檢測(cè)
            2.3.4 雙抗體夾心ELISA初步篩選單抗配對(duì)
            2.3.5 膠乳增強(qiáng)免疫比濁法單抗配對(duì)復(fù)篩
            2.3.6 膠乳粒子粒徑的優(yōu)化
            2.3.7 抗體標(biāo)記比例的優(yōu)化
            2.3.8 樣品稀釋液（R1）的選擇
            2.3.9 反應(yīng)體系的確定
        2.4 小結(jié)
    第三章 豬瘟病毒E2蛋白膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒的性能評(píng)價(jià)及應(yīng)用
        3.1 材料
            3.1.1 主要儀器
            3.1.2 主要試劑
            3.1.3 試劑配制
        3.2 方法
            3.2.1 試劑盒的檢測(cè)線性范圍
            3.2.2 試劑盒的檢測(cè)限
            3.2.3 試劑盒的準(zhǔn)確度
            3.2.4 試劑盒的精密度
            3.2.5 方法學(xué)比較
            3.2.6 樣品檢測(cè)
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 試劑盒的檢測(cè)線性范圍
            3.3.2 試劑盒的檢測(cè)限
            3.3.3 試劑盒的準(zhǔn)確度
            3.3.4 試劑盒的精密度
            3.3.5 方法學(xué)比較
            3.3.6 樣品檢測(cè)
        3.4 小結(jié)
    討論
    結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷

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