H5亞型禽流感病毒大多數(shù)都是高致病性的病原,一旦發(fā)生感染可造成家禽的大規(guī)模死亡,使養(yǎng)殖戶蒙受巨大的損失,同時(shí)H5亞型禽流感病毒也能感染人,甚至造成人員死亡。我國(guó)雞群中存在的H5亞型禽流感病毒,按照HA基因的親緣關(guān)系劃分,主要是Clade2.3.2、Clade7.2和Clade2.3.4.4分支的病毒。禽流感病毒一直不斷的發(fā)生基因變異,2015年零星發(fā)現(xiàn)Clade2.3.2分支出現(xiàn)新的小分支Clade2.3.2.1e,2016年在我國(guó)多個(gè)省份大范圍監(jiān)測(cè)到Clade2.3.2.1e分支,H5亞型不同分支之間抗原差異較大,并且隨著時(shí)間的推移,差異性越來(lái)越大,原來(lái)以單抗為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法逐漸出現(xiàn)更大的偏差和漏檢現(xiàn)象,因此,需要不斷的更新單抗來(lái)修訂。為此,本研究用H5亞型高致病性禽流感Clade7.2、Clade2.3.4.4分支和Clade2.3.2.1e分支的疫苗株,純化后作為免疫原,結(jié)合單抗制備技術(shù)制備和篩選覆蓋面較廣的H5亞型禽流感單抗,進(jìn)一步建立了以單抗為基礎(chǔ)的免疫膠體金試紙條和滲透卡檢測(cè)方法。本研究利用將Clade7.2分支疫苗株CK/LN/S4092/2011(H5N1)(Re-7),Clade2.3.4.4分支疫苗株DK/GZ/4/2013(H5N1)(Re-8)和Clade2.3.2.1e分支疫苗株DK/AH/S1246/14(H5N1)(Re-10)作為免疫原,混合免疫4周齡BALB/c雌鼠,4次免疫之后,無(wú)菌取其脾細(xì)胞,將其與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)在聚乙二醇促融劑的作用下進(jìn)行細(xì)胞融合,經(jīng)過(guò)間接ELISA方法及HI方法篩選得到6株能穩(wěn)定分泌抗血凝素蛋白HA的單抗雜交瘤細(xì)胞,分別命名為1B10、2A10、2C8、3E6、4G9和H2B1。經(jīng)檢測(cè)1B10、2A10、2C8和H2B1能與當(dāng)前流行的分支反應(yīng),具有較好的廣譜性。選用兩株反應(yīng)性較好的單抗2A10和2C8,用20 nm大小的膠體金顆粒對(duì)2A10抗體進(jìn)行標(biāo)記,10000轉(zhuǎn)離心純化,得到金標(biāo)抗體,以1:8倍稀釋噴涂于試紙條加樣孔附近的玻璃纖維上;2C8以1.5 mg/mL的濃度噴涂于檢測(cè)線;羊抗鼠二抗以1 mg/m L的濃度噴涂于質(zhì)控線,組裝成膠體金試紙條。利用免疫層析技術(shù)(GICA)檢測(cè)H5亞型禽流感病毒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該膠體金試紙條能檢出我國(guó)流行的H5亞型禽流感病毒,廣譜性較好,對(duì)其他亞型不反應(yīng),特異性較好,最小檢出的病毒量為2~4。為了進(jìn)一步提高它的敏感性,我們將2C8單抗和羊抗鼠二抗點(diǎn)到滲透卡中,制備斑點(diǎn)金免疫滲濾卡,利用斑點(diǎn)金免疫滲濾法(DIGFA)檢測(cè)H5亞型禽流感病毒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其最小檢出的病毒量為2~2,敏感性得到提高�？傊�,本研究通過(guò)雜交瘤技術(shù)篩選出6株1B10、2A10、2C8、H2B1、3E6和4G9抗HA單抗;以單抗為基礎(chǔ)材料,初步建立H5亞型禽流感病毒膠體金試紙條檢測(cè)方法和H5亞型禽流感病毒斑點(diǎn)金免疫滲濾卡檢測(cè)方法,滲透卡比膠體金試紙條靈敏性有所提高。
【學(xué)位單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

blotting 鑒定結(jié)果顯示：1B10、H2B1，推測(cè) 1B10、H2B1、4G9、3E6 單Re-7、Re-8 和 Re-10 毒株的約 70 ku表位，條帶 70 ku 對(duì)應(yīng)的是 HA 蛋 2A10 和 2C8 單抗對(duì)應(yīng)的表位在 H區(qū)域。 2A10 與 Re-7、Re-8 和 Re-10 Western bllotting of monoclonal antibody 2A10 and ReRe-7 Re-8 Re-10HAHARe-7 Re-8 Re-10A1

圖 2.1 單抗 2A10 的特異性Fig. 2.1 Specific of monoclonal antibody 2A10tting 分析 的 Western blotting 鑒定結(jié)果顯示：1B10、H2B1、4G9 和 3E6無(wú)明顯條帶，推測(cè) 1B10、H2B1、4G9、3E6 單抗所對(duì)應(yīng)的表抗分別在 Re-7、Re-8 和 Re-10 毒株的約 70 ku 和 40 ku 處出可能為線性表位，條帶 70 ku 對(duì)應(yīng)的是 HA 蛋白，條帶 40 k，進(jìn)一步推測(cè) 2A10 和 2C8 單抗對(duì)應(yīng)的表位在 HA1 蛋白上而的一段氨基酸區(qū)域。圖 2.2 單抗 2A10 與 Re-7、Re-8 和 Re-10 Western blotting 鑒定. 2.2 Western blotting of monoclonal antibody 2A10 and Re-7, Re-8 and ReRe-7 Re-8 Re-10HAHA1

圖 2.1 單抗 2A10 的特異性Fig. 2.1 Specific of monoclonal antibody 2 blotting 鑒定結(jié)果顯示：1B10、H2B，推測(cè) 1B10、H2B1、4G9、3E6 Re-7、Re-8 和 Re-10 毒株的約 70性表位，條帶 70 ku 對(duì)應(yīng)的是 HA 測(cè) 2A10 和 2C8 單抗對(duì)應(yīng)的表位在酸區(qū)域。Re-7 Re-8 Re-10HA
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2879407