黃體(CL)是卵巢排卵后迅速形成的一種特殊結(jié)構(gòu),通過(guò)分泌孕酮來(lái)維持妊娠。黃體發(fā)育與退化的分子機(jī)制一直是動(dòng)物繁殖領(lǐng)域研究的熱點(diǎn),其中細(xì)胞凋亡和血管發(fā)生伴隨黃體發(fā)育的整個(gè)過(guò)程,并且越來(lái)越多的證據(jù)表明miRNA在黃體功能發(fā)揮過(guò)程中扮演重要的角色。miR-29b是腫瘤發(fā)生過(guò)程中的有效調(diào)節(jié)因子,靶向調(diào)控細(xì)胞增殖,周期,衰老,分化,凋亡和轉(zhuǎn)移等過(guò)程。目前,已經(jīng)證明miR-29b在不同發(fā)育時(shí)期的牛黃體中差異表達(dá),然而,miR-29b在黃體中具體的功能和分子調(diào)控機(jī)制尚不明確。為了探索miR-29b在牛黃體中的功能,本研究通過(guò)RT-qPCR分析了miR-29b在不同發(fā)育時(shí)期牛黃體中的表達(dá)量變化,結(jié)果顯示miR-29b在黃體發(fā)育的各個(gè)時(shí)期都有表達(dá),表達(dá)量從早期到退化期逐漸降低,并且在后期黃體和退化期黃體中的差異不顯著。為了進(jìn)一步深入研究mi R-29b在牛黃體中的功能,本研究使用TargetScan,RNA22軟件對(duì)miR-29b的靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè),并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明了催產(chǎn)素受體(OXTR)是miR-29b在牛黃體中的一個(gè)靶基因。隨后,本研究利用Western blot和免疫組化方法檢測(cè)OXTR在不同發(fā)育時(shí)期牛黃體的表達(dá)規(guī)律,結(jié)果表明OXTR不僅在黃體發(fā)育的四個(gè)時(shí)期均有表達(dá),且在大、小黃體細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中非常明顯。而從前期黃體到退化期黃體,其蛋白表達(dá)水平也呈逐漸上升趨勢(shì)。由于miR-29b在黃體中具有明顯的差異表達(dá)并可能對(duì)黃體功能具有潛在影響,本研究對(duì)黃體細(xì)胞進(jìn)行了分離和體外培養(yǎng),并檢測(cè)了miR-29b對(duì)牛黃體細(xì)胞增殖及孕酮分泌的影響。首先利用miR-29b mimics/miR-29b inhibitor對(duì)黃體細(xì)胞中miR-29b分別進(jìn)行過(guò)表達(dá)和抑制,通過(guò)RT-qPCR、Western blot、ELISA以及流式細(xì)胞術(shù)等方法來(lái)檢測(cè)miR-29b對(duì)OXTR蛋白表達(dá)、細(xì)胞增殖及孕酮分泌的影響。結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)miR-29b能夠顯著降低OXTR的表達(dá),而抑制miR-29b幾乎不會(huì)影響OXTR的表達(dá)。過(guò)表達(dá)miR-29b能夠促進(jìn)牛黃體細(xì)胞孕酮的分泌,而抑制miR-29b則不會(huì)影響孕酮的合成。同時(shí),流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明過(guò)表達(dá)miR-29b可抑制牛黃體細(xì)胞的凋亡,而CCK8實(shí)驗(yàn)則證明了miR-29b的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)牛黃體細(xì)胞的增殖。綜上所述,在本研究中,本文分析了miR-29b在不同發(fā)育時(shí)期牛黃體中的表達(dá),并預(yù)測(cè)和驗(yàn)證了OXTR是miR-29b在牛黃體中的一個(gè)靶基因。miR-29b能夠降低OXTR蛋白的表達(dá)、影響孕酮分泌、抑制黃體細(xì)胞的凋亡并調(diào)節(jié)黃體的功能。本研究通過(guò)明確miR-29b及其靶基因在黃體中的表達(dá)規(guī)律及其對(duì)黃體細(xì)胞增殖與凋亡的影響,解析了miR-29b及其靶基因調(diào)控黃體功能的作用機(jī)制,為深入了解黃體在發(fā)情周期中的作用提供理論依據(jù),并為提高動(dòng)物繁殖力及黃體相關(guān)疾病的治療提供新方向。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S823
【部分圖文】：

第二篇 研究?jī)?nèi)容 第 1 章 miR-29b 及其靶基因 OXTR 在不同發(fā)育時(shí)期黃體中的表達(dá)規(guī)律分析miR-29b 在黃體中的表達(dá)趨勢(shì)和 OXTR 恰好相反，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 OXTR 可能是黃體中 miR-29b 的潛在靶基因之一。為了檢測(cè) OXTR 的沉默是否由 miR-29b-3p 和 OXTR 靶位點(diǎn)之間的特異性直接相互作用誘導(dǎo)，本文使用 TargetScan 程序預(yù)測(cè)了 OXTR-3'UTR 中miR-29b-3p 的靶位置（圖 1D）。 然后，本文構(gòu)建了 pmir-OXTR-3'UTR 和 pmir-突變體-OXTR-3'UTR 載體，并將 pmir-OXTR-3'UTR 共轉(zhuǎn)染到具有 miR-29b-3p模擬物的 HEK293T 細(xì)胞中，結(jié)果螢光素酶活性降低 30％；然而，miR-29b-3p模擬物和 pmir-mutant-OXTR-3'UTR 載體的共轉(zhuǎn)染后，本文沒(méi)有發(fā)現(xiàn)螢光素酶的活性發(fā)生顯著變化（圖 1E）。這表明 miR-29b-3p 可以調(diào)節(jié) OXTR 的表達(dá)，OXTR是 miR-29b 在牛黃體中的靶基因。

圖 1.2 OXTR 在不同發(fā)育階段黃體中的定位。圖（A），（B），（C）和（D）是不同發(fā)育時(shí)期牛黃體的 HE 染色結(jié)果。紅色箭頭表示大黃體細(xì)胞，藍(lán)色箭頭表示小黃體細(xì)胞。原始放大倍數(shù) 200 果。圖（E），（F），（G），（H）和（I）是不同發(fā)育階段牛黃體的免疫組織化學(xué)分析結(jié)果。比例尺，50um。Figure 1.2 Localization of OXTR at different CL developmental stages.(A), (B), (C) and (D) HE staining at different periods of bovine CL development. Redarrows indicate large CL cells, and blue arrows indicate small CL cells. Original magnification200×. (E), (F) (G), (H) and (I) Immunohistochemical analysis of OXTR localization duringdifferent stages of bovine CL development. Scale bar, 50 μm.3 討論3.1 黃體是卵巢內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的內(nèi)分泌器官。黃體由卵巢卵泡排卵后發(fā)育而成并誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜細(xì)胞分化；在沒(méi)有受精的情況下，黃體發(fā)生降解，黃體的形成和降解能夠調(diào)控機(jī)體激素水平[109]。因此，黃體細(xì)胞的正常生理過(guò)程在機(jī)體的

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1 miR-29b 能夠調(diào)控牛黃體細(xì)胞中的 OXTR 蛋白水平為了進(jìn)一步研究 miR-29b 對(duì)牛黃體細(xì)胞中 OXTR 的調(diào)控作用，本文用miR-29b mimics、miR-29b inhibitor 以及 NC 組轉(zhuǎn)染黃體細(xì)胞。使用 RT-qPCR測(cè)量轉(zhuǎn)染效率。miR-29b mimics 的轉(zhuǎn)染能夠顯著增加 miR-29 的表達(dá)水平，并且用 miR-29b inhibitor 轉(zhuǎn)染后能夠顯著降低 miR-29b 的表達(dá)水平，這表明轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)是成功的，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）（圖 1A）。 同時(shí)，本文分析了OXTR 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)用 miR-29b 轉(zhuǎn)染能夠降低了 OXTR 表達(dá)，但用 inhibitor轉(zhuǎn)染則對(duì) OXTR 蛋白的表達(dá)影響不大（圖 1B，C 和 D）。 基于雙熒光素酶報(bào)告分析及轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)這些結(jié)果，本文認(rèn)為 miR-29b 可以降低牛黃體細(xì)胞中 OXTR 的表達(dá)，表明 OXTR 是 miR-29b 靶基因。
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本文編號(hào)：2873560