隨著人們消費水平的提高,羊肉因其肉質(zhì)細嫩、易消化、富含蛋白質(zhì)和維生素等特點而越來越受廣大消費者的青睞。羊大腸桿菌病因為其發(fā)病率高和其所導(dǎo)致的死亡率高,給養(yǎng)羊業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。傳統(tǒng)使用抗生素治療的方法存在多種缺陷,而從遺傳學(xué)入手,可為提高和改善湖羊抗病能力提供新思路。本試驗以湖羊為研究對象,通過組織塊法及單克隆法,分離純化湖羊小腸上皮細胞,并通過細胞角蛋白18免疫熒光鑒定法來分析鑒定;對湖羊羔羊口服F17大腸桿菌菌株獲得非腹瀉和腹瀉型個體,利用RNA-seq篩選出差異1ncRNA(DE 1ncRNAs),并用RT-qPCR驗證它們的相對表達水平,GO和KEGG富集分析以及1ncRNA-mRNA互作分析,進一步篩選關(guān)鍵DE 1ncRNAs;檢測TCONS 00089751在湖羊心、肝、脾、肺、腎、空腸、回腸、十二指腸組織的表達量,構(gòu)建TCONS 00089751過表達載體并轉(zhuǎn)染湖羊小腸上皮細胞,RT-qPCR檢測EFB41L2、FUT1/2、CDK1、CDK2、CDK4和 CASP3 的表達量,通過 CCK-8 檢測 TCONS 00089751對小腸上皮細胞增殖的影響,通過凋亡試驗檢測其對小腸上皮細胞凋亡的影響,利用Miranda預(yù)測與TCONS 00089751競爭性結(jié)合的miRNA,進一步篩選并通過雙熒光素酶報告驗證靶向關(guān)系。主要研究結(jié)果如下:1.體外分離了湖羊小腸上皮細胞,顯微鏡中觀察到湖羊小腸上皮細胞呈橢圓型,細胞之間緊密相連,細胞形態(tài)一致。經(jīng)免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)小腸上皮細胞的特異性抗體角蛋白18抗原呈陽性表達,表明成功分離得到湖羊小腸上皮細胞,為后續(xù)進行功能驗證提供了材料。2.利用RNA-seq,對腹瀉型與非腹瀉型羔羊個體的脾臟組織進行測序,共篩選出DE 1ncRNAs 34個,隨機選擇6個DE 1ncRNAs,用RT-qPCR驗證它們在腹瀉組和非腹瀉組羔羊脾臟組織中的相對表達水平,發(fā)現(xiàn)兩組間存在顯著差異(P0.05)。通過GO和KEGG Pathway富集分析,結(jié)果表明34條DE 1ncRNAs被注釋和分類到302個功能亞類和149個KEGG通路中。通過1ncRNA-mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)分析,篩選了 5個1ncRNAs,以及6個可能被其相關(guān)1ncRNA調(diào)控的基因:MYO1G、71MM29、CARM1、EPB41L2、SEPT4、DESI2。3.檢測了 TCONS 00089751在各組織中的表達量,發(fā)現(xiàn)除心臟組織外,其余各組織中,非腹瀉組中TCONS 00089751的表達量均高于腹瀉組,且?guī)缀醵歼_到顯著水平。過表達TCONS_00089751發(fā)現(xiàn),EPB41L2表達量顯著變化,黏附相關(guān)基因FUT1/2表達量顯著下調(diào);細胞增殖相關(guān)基因CDK1、CDK2和CDK4表達量下降但不顯著;凋亡相關(guān)基因CASP3顯著上調(diào);CCK-8試驗結(jié)果顯示TCONS_00089751對湖羊小腸上皮細胞的增殖沒有明顯作用;凋亡試驗結(jié)果顯示TCONS_00089751促進湖羊小腸上皮細胞的凋亡。利用Miranda共預(yù)測出9個可能與TCONS_00089751競爭性結(jié)合的miRNA,通過雙熒光素酶報告試驗發(fā)現(xiàn)TCONS_00089751與oar-miR-541-3p和oar-miR-134-3p存在靶向關(guān)系。
【學(xué)位單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S858.26
【部分圖文】：

６?揚州大學(xué)碩士學(xué)位論文???３．３．１?ＩｎｃＲＮＡ和染色質(zhì)調(diào)節(jié)??通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)，ＩｎｃＲＮＡ已成為調(diào)控轉(zhuǎn)錄的重要參與者［４８＿５（）］。ＩｎｃＲＮＡｓ在不同的功??能中調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，包括組蛋白修飾，ＤＮＡ甲基化和染色質(zhì)重塑。在廣泛的進化譜中，??盡管ＩｎｃＲＮＡ缺乏一級序列的保護，但它們在染色質(zhì)調(diào)節(jié)功能中仍體現(xiàn)了其保守作用。??３．３．２?ＩｎｃＲＮＡ通過組蛋白修飾調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)??ＩｎｃＲＮＡ與組蛋白修飾復(fù)合物（ＰＲＣ１尤其是ＰＲＣ２）的相互作用非常突出，圖１－２?ａ??描述了?ＩｎｃＲＮＡ調(diào)控組蛋白修飾的一般機制。??３染色質(zhì)重塑／組蛋白修飾?卜ｃ??Ｃ?ＳｔａｕｆｅｎｍＲＭ衾

ＰＢＳ輕洗３次，每次約５?ｍｉｎ，以防細胞脫落。??的馬血清，室溫封閉３０ｍｉｎ，棄血清。??（Ａｎｔｉ－Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ?１８，１：?１００），４°Ｃ，過夜。??輕洗３次，５?ｍｉｎ／次，加入ＦＩＴＣ標記的羊抗鼠二抗（１：３次，５?ｍｉｎ／次，加入ＤＡＰＩ染色，室溫５?ｍｉｎ，注意避３次，５?ｍｉｎ／次，最后用蒸餾水清洗１次，熒光顯微鏡觀皮細胞的原代培養(yǎng)??分離培養(yǎng)細胞，７？１〇天時得到的細胞如圖２－１所示，組輻射。在倒置顯微鏡下觀察到，成纖維細胞呈扁平狀，種細胞混雜生長。??

４．２湖羊小腸上皮細胞的純化與克隆??將細胞稀釋至大約１個／孔鋪入９６孔板，培養(yǎng)７天時可在顯微鏡下觀察到細胞集中??生長，如圖２－２所示，９６孔板中的細胞貼壁生長，細胞與細胞之間緊密相連，且細胞形??態(tài)一致。??ｒ國響關(guān)??ｍ?．，??圖２－２用單克隆法獲得湖羊小腸上皮細胞（５〇ｘ）??Ｆｉｇｕｒｅ?２－２?Ｏｂｔａｉｎｉｎｇ?ｓｍａｌｌ?ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ?ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ?ｃｅｌｌｓ?ｆｒｏｍ?Ｈｕ?ｓｈｅｅｐ?ｂｙ?ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ?ｍｅｔｈｏｄ?（５０＞Ｏ??４．３湖羊小腸上皮細胞的鑒定??通過對細胞角蛋白１８抗原和細胞核分別進行染色，在顯微鏡下看到的結(jié)果如圖２－３??所示，然后將兩者進行融合，細胞表面發(fā)出綠色熒光，表明試驗培養(yǎng)得到的細胞為湖羊??小腸上皮細胞。???圖２－３細胞角蛋白１８免疫熒光鑒定??Ｆｉｇｕｒｅ?２－３?Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ?１８?ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ??
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6 唐文忠;裂褶菌F17對染料脫色的研究及偶氮染料剛果紅降解產(chǎn)物的分析[D];安徽大學(xué);2007年

7 盧彩景;鴨源雞桿菌中國分離株F17樣菌毛基因的鑒定及其敲除株的構(gòu)建[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

本文編號：2870160