豬圓環(huán)病毒病(Porcine circovirus disease,PCVD),是由豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)引起的一種豬多種疾病綜合征的慢性傳染病,主要危害斷奶仔豬。其因高傳染率,低死亡率,可以造成感染機(jī)體的免疫抑制等特點(diǎn),給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗免疫是目前控制PCV2感染,防治PCVD的最重要,最有效的手段。目前,市場上商品化疫苗各種各樣,安全性與有效性差異較大。因此,如何正確、科學(xué)的選擇安全高效的豬圓環(huán)病毒疫苗,進(jìn)行有效的豬圓環(huán)病毒防控是目前養(yǎng)豬場(戶)面臨的急需解決的問題。因此,建立科學(xué)、合理、簡便易行的評價(jià)商品化PCV2疫苗安全、效力評價(jià)指標(biāo)體系,并進(jìn)行不同佐劑的疫苗安全、效力效果比較,對養(yǎng)豬生產(chǎn)上選擇安全高效的疫苗和新型疫苗研制具有重要意義。本研究分別選取水性佐劑、蜂膠-VSP復(fù)合佐劑、蜂膠-VCG復(fù)合佐劑、鯊?fù)?VCG復(fù)合佐劑、免疫增強(qiáng)劑等不同佐劑的8種PCV2 VLPs商品化疫苗與試驗(yàn)疫苗,分別涵蓋了桿狀病毒表達(dá)載體VLP疫苗和大腸桿菌表達(dá)VLP疫苗,平行進(jìn)行昆明小鼠、仔豬的安全性和效力比對評價(jià)。通過安全指數(shù)(包含內(nèi)容:相對增重、體溫、飲食,精神狀態(tài),接種部位等指標(biāo))、組織學(xué)病理觀察等指標(biāo)評價(jià)疫苗的安全性,通過血清PCV2抗體效價(jià),實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法定量檢測組織和外周血淋巴細(xì)胞IL-10、IL-17A、IFN-γ的mRNA轉(zhuǎn)錄水平,ELISA方法測定外周血中IL-2和IL-4蛋白表達(dá)水平,PCV2攻毒保護(hù)和組織核酸載量等指標(biāo)評價(jià)疫苗的免疫效力。試驗(yàn)結(jié)果顯示:本文建立了6個(gè)小鼠和仔豬相對應(yīng)的IFN-γ、IL-17A、IL-10的SYBR GreenⅠRT-PCR檢測方法,適用于臨床定量檢測IFN-γ、IL-17A、IL-10的mRNA表達(dá)水平;安全試驗(yàn)比較結(jié)果表明:C、E、F組PCV2疫苗在小鼠和仔豬中的安全指數(shù)顯著高于其它疫苗,其中E組最高;H組的疫苗免疫小鼠后對免疫部位的病變少且對免疫部位肌肉刺激小,其次是A組和F組;效力試驗(yàn)比較結(jié)果表明:G組和H組疫苗效力在小鼠和仔豬中均較其它組疫苗高,并且誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生偏向體液免疫型的免疫應(yīng)答,其中G組疫苗免疫仔豬后,IFN-γ和IL-17A的mRNA表達(dá)量升高,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高于其它各組的特異性免疫。本文成功建立了安全指數(shù),抗體效價(jià),細(xì)胞免疫因子,免疫抑制因子,病毒載量“五位一體”的疫苗檢驗(yàn)金標(biāo)準(zhǔn)。用該標(biāo)準(zhǔn)比較分析了8種不同佐劑的PCV2疫苗安全性和效力結(jié)果表明,丁公司G疫苗和H疫苗免疫效果最好,能顯著增強(qiáng)豬群的特異性免疫和非特異性免疫,減少對免疫部位的刺激,具有良好的安全性,該研究為PCV2疫苗的安全性、效力檢驗(yàn)和臨床推廣應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支撐。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S858.28
【部分圖文】：

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士專業(yè)學(xué)位論文表 13 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度及拷貝數(shù)Table13 Concentration and copy number belonging of standard plasmid類別Category小鼠 仔豬IL-10 IL-17A IFN-γ IL-10 IL-17A IFN-γ重組質(zhì)粒濃度（ng/μL） 129.9 207 93.7 97.3 73.5 117.3拷貝數(shù)（cop/μL） 3.87×10106.44×10102.89×10102.98×10102.29×10103.78×1010

八種 PCV2 VLPs 疫苗免疫效果評價(jià)比較3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立3.1.3.1 擴(kuò)增曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線選取 6 或 8 個(gè)梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，即 101~106或 108拷貝/μL，進(jìn)行熒光定量 PCR檢測，得到細(xì)胞因子的 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 擴(kuò)增曲線，如圖 2 所示，呈“S”型曲線。在 101~106或 108拷貝/μL 時(shí)（擴(kuò)增曲線由左至右分別為 108或 106~101拷貝/μL），細(xì)胞因子的 Ct 值與濃度之間有較好的線性關(guān)系，且 R2≥0.99，說明相關(guān)性良好，可信度較高，如圖 3。

標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3Standardcurveline
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2868592