豬瘟(Classical Swine Fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的一種豬的高度接觸性傳染病。豬瘟分布廣泛,死亡率高,是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要傳染性疫病。目前,我國豬瘟防控工作主要還是采取豬瘟兔化弱毒疫苗預(yù)防接種的方式進行,定期對免疫后畜群進行血清抗體檢測可以評估疫苗免疫效果,改進和優(yōu)化疫苗免疫程序,有效地預(yù)防和控制豬瘟。本研究在E.coli中表達(dá)了CSFV的結(jié)構(gòu)蛋白E0和C,以純化和鑒定后具有免疫反應(yīng)性的蛋白作為包被用抗原,分別建立了CSFV血清抗體間接ELISA檢測方法,為CSFV抗體監(jiān)測提供了新的選擇。研發(fā)的CSFV阻斷ELISA抗體檢測試劑盒經(jīng)試驗證明,其敏感性、特異性和穩(wěn)定性良好,可以應(yīng)用于臨床疫苗免疫后抗體水平監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查的工作中。用豬瘟疫苗免疫豬,在免疫后0,7,14,21,28,35,50天收集血清樣品,應(yīng)用重組E2蛋白作為抗原建立的阻斷ELISA方法檢測E2蛋白抗體消長;分別使用重組E0和C蛋白作為抗原建立的間接ELISA方法,檢測免疫過程中抗兩種抗原的血清抗體變化特征�？贵w檢測結(jié)果顯示:疫苗免疫后第7天即可在血清中檢測到抗結(jié)構(gòu)蛋白E2、E0和C的相應(yīng)抗體,其中針對E2和E0抗原的抗體在免疫后第21天時達(dá)到最高水平,E2抗體水平總體呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢;抗E0抗原的抗體在免疫后21天之后有所下降并最終趨于穩(wěn)定狀態(tài);C蛋白抗體在第7天時出現(xiàn),隨后開始下降,在第28天轉(zhuǎn)為陰性。應(yīng)用建立的ELISA血清抗體檢測方法分析疫苗免疫后針對3種結(jié)構(gòu)蛋白的抗體變化特點,可為獸醫(yī)臨床CSF疫苗免疫程序的制定提供有意義的數(shù)據(jù)參考。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.4
【部分圖文】：

.1.2.6 RT-PCR 方法檢測豬瘟疫苗免疫后在豬體內(nèi)的代謝情況使用豬外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒從疫苗免疫后定期采得抗凝血中分離外周血淋巴細(xì)胞提取總 RNA，利用 RT-PCR 方法擴增 CSFV E2 基因。1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，膠回收目的基因片段進行序列測定與分析。.2 結(jié)果與分析.2.1 豬瘟病毒阻斷 ELISA 抗體檢測試劑盒的穩(wěn)定性研究4 ℃試驗組 OD450nm 值和阻斷率結(jié)果如圖 2.1 所示；37 ℃加速熱穩(wěn)定性試驗組 OD450nm阻斷率結(jié)果如圖 2.2 所示。在兩組試驗過程中，陽性對照和 2 份已知陽性血清的 OD450nm 值有顯著變化，但陰性對照和 2 份已知陰性血清的 OD450nm 值有顯著下降。根據(jù)檢測結(jié)果 Om 值計算阻斷率，結(jié)果顯示：在試驗過程中，陽性對照和 2 份已知陽性血清的阻斷率一直在，但一直高于臨界值 40% 阻斷率，而 2 份已知陰性血清的阻斷率一直低于臨界值。此外，個試驗過程中，陰性對照血清的 OD450nm 值總不小于 0.5，陽性對照血清的阻斷率總高于 40足試劑盒結(jié)果成立的有效性標(biāo)準(zhǔn)。

圖 2.2 37℃試驗組血清 OD450nm 值 (C) 和阻斷率 (D) 變化情況Fig.2.2 Changes of the OD450nm value (C) and the blocking ratio (D) of sera in 37 C group.07425-1 和 07425-6 是已知的 CSFV 抗體陰性血清；07425-3 和 07425-4 是已知的 CSFV 抗體陽性血清。Figure D 中黑色橫線代表臨界值 40% 阻斷率。07425-1 and 07425-6 were known CSFV antibody-negative sera; 07425-3 and 07425-4 were known CSFV antibody- positive sera. The black lineshown in the figure D represents a cut-off value of 40% of the blocking ratio.2.2.2 豬瘟病毒阻斷 ELISA 抗體檢測試劑盒的特異性利用豬瘟病毒阻斷 ELISA 抗體檢測試劑盒檢測 PCV2、PRRSV、PRV 和 BVDV 陽性血清，分別計算其阻斷率。結(jié)果顯示：PCV2、PRRSV、PRV 和 BVDV 陽性血清的檢測結(jié)果均為陰性(表2.1)。表明該試劑盒特異性良好。表 2.1 交叉反應(yīng)試驗結(jié)果Table 2.1 Results of the cross-reaction test陽性血清（Positive sera）PCV2 PRV PRRSV BVDV

圖 2.3 血清 IFA 檢測結(jié)果Fig.2.3 Results of the sera detected by IFA.T 細(xì)胞接毒 48 h 后處理細(xì)胞進行 IFA 試驗，用 DAPI 染細(xì)胞核，從樣本中檢測到的特異性免疫染色代表血清樣本中存在 C體。放大倍數(shù) 40 ×。ST cells were harvested at 48 h.p.i and processed for IFA. All nuclei were stained with DAPI. Specific immunostaining detected frosample indicated the presence of CSFV antibodies in serum samples. Magnification is 40×.表 2.4 117 份血清的 IFA 試驗結(jié)果Table 2.4 Summary of the 117 inconsistent sera detection results by IFA81 IDEXX ELISA - / bELISA + samples 36 IDEXX ELISA + / bELISA – sample 54 10 27 26.5 RT-PCR 方法檢測外周血淋巴細(xì)胞中 CSFV E2 結(jié)果在疫苗免疫后第 7 天和第 14 天的 8 頭實驗豬樣品中均可以擴增得到大小約 700 bp 的基圖 2.4），目的基因片段切膠回收序列測定的結(jié)果在 GenBank 中比對證實確為豬瘟病毒
【參考文獻】

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本文編號：2853913