發(fā)布時間：2020-10-21 18:46

　　 A亞群禽白血病是由A亞群禽白血病病毒(subgroup A of avian leukosis virus,ALV-A)引發(fā)的傳染性腫瘤性疾病,主要引起感染雞長期病毒血癥、生長緩慢、免疫抑制、生產(chǎn)性能下降、多組織腫瘤甚至死亡等。該病在我國雞群中感染率非常高,僅次于J亞群禽白血病,每年對我國的養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對該病尚無有效的藥物和疫苗,采用淘汰陽性雞、實(shí)施種雞凈化是目前控制該病的主要方法。建立特異、靈敏、快速檢測ALV-A的方法是這一防控措施的關(guān)鍵核心技術(shù)�，F(xiàn)有的檢測ALV-A方法繁瑣、需要特異設(shè)備、耗時長,很難滿足臨床大批量檢測需要。本研究基于膠體金免疫結(jié)合和層析原理,通過制備ALV-A的多克隆抗體(pAb)和單克隆抗體(mAb),優(yōu)化反應(yīng)條件,研制ALV-A膠體金檢測試紙條,對該試紙條性能進(jìn)行比較分析,結(jié)合臨床樣品檢測評價其適用性,為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。本研究首先通過原核表達(dá)方法制備ALV-A gp85重組蛋白,純化后免疫接種兔,四次免疫后取血清,制備pAb,ELISA方法檢測抗體滴度和IFA法檢測抗體特異性。用實(shí)驗(yàn)室制備的ALV-A單克隆雜交瘤細(xì)胞株A14GZ接種于Balb/c小鼠,制備腹水,獲得ALV-A mAb,檢測抗體滴度和抗體特異性。優(yōu)化反應(yīng)條件,利用一定大小的膠體金顆粒與mAb制備納米膠體金標(biāo)記抗體溶液。pAb包被試紙條硝酸纖維素膜(NC膜),按照膠體金檢測試紙條制備方法研制ALV-A膠體金檢測試紙條。用已知的ALV-A/B/J/K毒株檢測膠體金檢測試紙條的特異性,用一定量含ALV-A病毒稀釋液和gp85蛋白檢測試紙條的靈敏度,在4℃、25℃、37℃條件下分別保存試紙條6個月,用已知ALV-A病毒溶液檢測試紙條的穩(wěn)定性。收集ALV-A病毒感染種雞的血液、泄殖腔棉拭子、蛋清樣品,用研制的膠體金試紙條與IDEXX公司的ALV p27抗原ELISA檢測試劑盒進(jìn)行比較檢測,評價試紙條的適用性,分析結(jié)果。結(jié)果顯示:(1)制備的ALV-A gp85蛋白的大小為46 KDa,獲得的pAb和mAb的抗體滴度分別為1:10~6和1:2~(13),IFA和Western-blot結(jié)果顯示兩種抗體均特異性的結(jié)合ALV-A和gp85包膜蛋白。(2)采用氯金酸和檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液的膠體金顆粒大小為20 nm;用mAb和pAb分別作為標(biāo)記抗體和檢測抗體,膠體金-抗體復(fù)合物反應(yīng)體系的最佳pH值為8.3,抗體的最佳工作濃度為16.8μg/mL。(3)該試紙條能特異性識別ALV-A,但不能識別ALV-B/J/K;對ALV-A的檢測下限為64 TCID_(50)/mL,對ALV-A gp85蛋白的檢測下限為80 ng/mL;在4℃保存180 d、25℃保存60 d以及37℃保存15 d都具有較好的反應(yīng)性。(4)該膠體金檢測試紙條與國際商業(yè)化ALV抗原ELISA檢測試劑盒比較結(jié)果顯示,二者泄殖腔棉拭子樣本陽性和陰性重合率為94.06%(190/202),血液樣本為95.2%(119/125),蛋清樣本為95.31%(61/64);而PCR結(jié)果顯示,試紙條的假陽性率遠(yuǎn)低于ELISA。同時,所研制的試紙條具有檢測快速、成本低廉、不需特殊設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。以上結(jié)果表明:成功研制ALV-A的納米膠體金檢測試紙條,具有特異、靈敏、快速檢測ALV-A的特性,可適用于ALV-A的臨床批量樣本檢測。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.65;S852.4
【部分圖文】：

g 基因編碼的(Hunter et al., 1983)。p27 蛋白是 ALV 的抗原特異性蛋白，其結(jié)構(gòu)中有的易于 ALV 檢測的抗原位點(diǎn)，目前臨床上很多試劑盒主要通過檢測 p27 蛋白來確LV。pol 基因編碼逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶，此中逆轉(zhuǎn)錄酶的目的是將病毒從 RNA 反轉(zhuǎn)錄NA 的目的，整合酶的目的是將病毒整合到宿主細(xì)胞染色體內(nèi)。gap 和 pol 這兩種基列高度保守且同源性高。gp37 和 gp85 兩種糖蛋白是病毒的包膜蛋白由 env 基因編愛建, 1999)，這兩種蛋白黏附在病毒包膜上是通過二硫鍵和其他非共價鍵作用(柴等, 2009)。gp37 是一種鑲嵌蛋白，其任務(wù)是把病毒轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞里。gp85 則是一膜蛋白，承擔(dān)辨別宿主細(xì)胞膜上的特異性病毒受體含受體決定簇，決定 ALV 的特及中和活性(王增福等, 2005; Dorner et al., 1985)。鑒于 gp85 基因在 ALV 各個亞群存在很大的差異性，利用這個特點(diǎn)可以對 ALV 的亞型確定分析。針對 gp85 基因的性，已經(jīng)有采用表達(dá) gp85 蛋白用來制作 mAb 和亞單位疫苗(Bova, 1986; Bova-H91)，為疾病防治提供了理論基礎(chǔ)。

A 亞群禽白血病病毒（ALV-A）膠體金檢測試紙條的研制生素、多肽素等并且不影響其生物學(xué)特性。膠體金可以標(biāo)記抗體或抗原，測方法也有所不同有間接法、競爭法、雙抗夾心法等。當(dāng)然雙抗夾心法是目的的檢測方法，通過兩種抗體對抗原上的不同位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合，該方法具有高敏度，對于一些大分子物質(zhì)例如病毒、蛋白等通常是采用雙抗夾心法檢測。的檢測試紙條的基本原理：將吸取的樣品到樣品墊上，抗原從樣品墊移動到程，在移動中，抗原會聯(lián)合在金標(biāo)墊上的膠體金-抗體復(fù)合物并連續(xù)挪動到 N和 C 線；在 T 線處，抗原結(jié)合的膠體金-抗體復(fù)合物會與 T 線上的檢測抗體集在 T 線達(dá)到顯色，而多余的膠體金-抗體復(fù)合物會再次向 C 線移動；在 C -抗體復(fù)合物與 C 線上質(zhì)檢抗體的聯(lián)合，匯集的膠體金顆粒也在 C 線中呈現(xiàn)紅，當(dāng) T 線和 C 線同時呈現(xiàn)紅色時，則結(jié)果為陽性；只有 C 先呈現(xiàn)紅色判定，當(dāng) T 線和 C 線無顏色變化，或只有 T 線顯示紅色時，則結(jié)果無效（見圖

圖 3 膠體金檢測試紙條的結(jié)構(gòu)組成Fig.3 The structural composition of the colloidal gold test strip膠體金檢測試紙條在人類醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用體金免疫層析法由于它的許多優(yōu)點(diǎn)被應(yīng)用于各個方面。在人類醫(yī)學(xué)方面，這項(xiàng)以來被廣泛使用�，F(xiàn)在，這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用最為常見最為成熟的應(yīng)用于早孕膠體金條，用于婦女是否懷孕進(jìn)行初步的檢測，采取雙抗夾心法檢測懷孕的婦女尿液
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2850469