防御素是伴隨著人們對(duì)抗生素毒副作用的逐漸認(rèn)識(shí)而發(fā)展起來(lái)的,許多防御素對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒等均具有抑制作用,不易產(chǎn)生耐藥性,穩(wěn)定性良好,可制成新型抗菌藥物或用于飼料添加劑和食品防腐劑等。目前對(duì)禽類β-防御素的研究比較熱門,許多雞β-防御素已被克隆和表達(dá),并且通常具有抗菌活性,但對(duì)雞β-防御素Gal-4基因的克隆和表達(dá)的研究未見(jiàn)報(bào)道,筆者利用基因工程技術(shù),獲得了Gal-4的重組蛋白,并對(duì)其抑菌活性進(jìn)行鑒定,最后利用這種蛋白進(jìn)行了細(xì)菌感染小鼠的預(yù)防及治療研究。為開(kāi)發(fā)新型的抗菌藥物做出了一定貢獻(xiàn),為篩選和鑒定具有良好生物活性的防御素提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),為Gal-4在獸醫(yī)臨床中的應(yīng)用提供了很好的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下:從雞骨髓中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增雞β-防御素Gal-4成熟肽區(qū)基因,將目的基因克隆到原核表達(dá)載體pET-30a的BamHI和HindIII雙酶切位點(diǎn)上,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-30a-Gal-4,轉(zhuǎn)化于大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中,菌液經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE與Western blotting檢測(cè),并對(duì)重組蛋白進(jìn)行Ni柱親和層析純化與脫鹽濃縮處理。結(jié)果表明,成功擴(kuò)增了大小為148 bp的目的基因,并構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-30a-Gal-4,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后可檢測(cè)到大小在14 kDa左右的目的蛋白。經(jīng)純化后得到濃度為0.8 mg/mL的重組蛋白,SDS-PAGE顯示在14 kDa左右出現(xiàn)了清晰的目的條帶。為了鑒定重組蛋白Gal-4的體外抑菌活性,使用金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌進(jìn)行了初步研究,試驗(yàn)采用打孔法和細(xì)菌生長(zhǎng)曲線法鑒定重組蛋白Gal-4對(duì)金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌的抑菌活性。結(jié)果表明,重組蛋白Gal-4對(duì)金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌均出現(xiàn)了良好的抑菌效果。把重組蛋白Gal-4作為一種新型抗菌藥物,用于預(yù)防和治療金黃色葡萄球菌感染小鼠模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白Gal-4在小鼠體內(nèi)發(fā)揮了良好的殺菌作用,起到了一定的預(yù)防和治療動(dòng)物疾病的效果。
【學(xué)位單位】：塔里木大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.4
【部分圖文】：

圖 2-1 Gal-4 成熟肽區(qū)基因 PCR 擴(kuò)增結(jié)果：DL2000 DNA Maker；1-2：Gal-4 成熟肽區(qū)基PCR amplification results of Gal-4 mature peptide rL2000 DNAMaker；1-2：Gal-4 mature peptide reg

重組質(zhì)粒pET-30a-Gal-4的菌液PCR鑒定

圖 2-3pET-30a-Gal-4 重組蛋白 SDS-PAGE 檢測(cè)Fig. 2-3 detection of pET-30a-Gal-4 histone SDS-PAGE1：蛋白 Maker；2：空質(zhì)粒大腸桿菌；3-9：分別為終濃度 0 mM、0.25 mM0.5 mM、0.75mM、1 mM、1.25 mM、1.5 mM 的 IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo) 8 h 的結(jié)果。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2839993