脯氨酸為環(huán)狀α-亞氨基酸,在蛋白合成、機(jī)體的新陳代謝、傷口愈合、抗氧化及免疫反應(yīng)均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)外源性添加適量的脯氨酸,可以促進(jìn)胚胎、胎盤和孕體的生長(zhǎng)發(fā)育,預(yù)防胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩(intrauterine fetal growth retardation,IUGR),并且在新生兒發(fā)育的初期階段作為一種條件性必需氨基酸發(fā)揮重要作用。本研究擬探討脯氨酸影響胎兒發(fā)育及胎盤細(xì)胞增殖的分子機(jī)理,以便為應(yīng)用脯氨酸提高母豬的繁殖性能提供理論依據(jù)。首先,探討了在環(huán)江香豬日糧中添加1%脯氨酸對(duì)妊娠70日齡胎兒和胎盤發(fā)育及相關(guān)指標(biāo)的影響。結(jié)果顯示:脯氨酸試驗(yàn)組的平均胎兒為122.07±29.43g,顯著高于對(duì)照組(96.06±11.62g,P0.05)。脯氨酸試驗(yàn)組的平均妊娠胎兒數(shù)為7.87±0.35個(gè),與對(duì)照組的6.87±0.40個(gè)相比略有增加,但差異不顯著(P0.05)。脯氨酸試驗(yàn)組的胎盤組織糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid,GC)含量為20.34±0.24 ng/mL,空白對(duì)照組的為21.31±0.31 ng/mL,即脯氨酸顯著下調(diào)了胎盤組織的GC含量(P0.05)。脯氨酸試驗(yàn)組的糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor,GR)mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.67±0.02,空白對(duì)照組為1.10±0.01,說明脯氨酸組與空白對(duì)照組相比,GR mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下降(P0.05)。試驗(yàn)組的GRα和GRβ蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.02和1.21±0.01,而對(duì)照組GRα和GRβ蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.02±0.03和1.11±0.01,即脯氨酸試驗(yàn)組和對(duì)照組的GRα和GRβ蛋白表達(dá)水平均無顯著差異(P0.05)。在對(duì)豬表達(dá)的7種GR exon 1變體檢測(cè)中,只發(fā)現(xiàn)GR exon 1-5和exon 1-9在環(huán)江香豬胎盤組織中有表達(dá),且脯氨酸試驗(yàn)組中GRexon1-5的mRNA水平表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05),而GRexon1-9的表達(dá)水平差異不顯著(P0.05)。其次,以體外培養(yǎng)胎盤絨毛膜細(xì)胞(BeWo)為模型,初步探討了脯氨酸調(diào)控胎盤細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制。用添加不同濃度脯氨酸(0μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、7.5μg/mL、10μg/mL、12.5μg/mL 和 15μg/mL)的培養(yǎng)液培養(yǎng) BeWo 細(xì)胞24h、48h和72h后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)用添加2.5μg/mL和5μg/mL脯氨酸的培養(yǎng)液培養(yǎng)BeWo細(xì)胞48 h可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡。采用此濃度和時(shí)間組合分析了脯氨酸對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響。QRT-PCR分析結(jié)果顯示:添加2.5μg/mL和5μg/mL的脯氨酸可顯著提高BeWo細(xì)胞的周期蛋白依賴性激-4(cyclin-dependent kinase-4,CDK4)、氧化低密度脂蛋白受體(oxidized low density lipoprotein receptor-1,OLR1)和抗凋亡基因 B 淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bc12)的mRNA表達(dá)水平(P0.01),而對(duì)凋亡基因含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteine aspartate-specific protease-3,Caspase-3)和Bcl-2 相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated x protein,Bax)的表達(dá)無顯著影響(P0.05)。此外,處理組的GRmRNA和蛋白的表達(dá)量均顯著下調(diào)(P0.05),調(diào)控GR表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子特異性蛋白-1(Specificityprotein1,Sp1)和環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)的 mRNA 表達(dá)亦均顯著下降(P0.05),而轉(zhuǎn)錄因子Sp1的負(fù)調(diào)控因子腫瘤抑制基因(tumor suppressor gene,p53)mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)(P0.05)。添加 5μg/mL 脯氨酸對(duì)BeWo細(xì)胞的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋-5(Amino acid transporter-5,SLC7A5)和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的 mRNA 表達(dá)水平無顯著影響(P0.05),但添加2.5μg/mL脯氨酸則顯著上調(diào)BeWo細(xì)胞的SLC7A5和mTOR 表達(dá)水平(P0.05)。以上結(jié)果表明,脯氨酸可能是通過下調(diào)exon1-5mRNA的表達(dá),抑制GR mRNA的轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致胎盤組織中的GC含量下降,從改善了環(huán)江香豬胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩的現(xiàn)象。脯氨酸促進(jìn)胎盤絨毛膜細(xì)胞的增殖可能是通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Sp1和CREB mRNA的表達(dá),上調(diào)Sp1的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子p53的表達(dá),從而進(jìn)一步抑制了 GR基因和GR蛋白的表達(dá)水平,進(jìn)而引起了信號(hào)通路上mTOR和SLC7A5表達(dá)上調(diào)實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S828
【部分圖文】：

３糖皮質(zhì)激素作用機(jī)制圖．??ｉｇ．?３?Ｔｈｅ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ?ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．??．４轉(zhuǎn)錄因子對(duì)ＧＲ轉(zhuǎn)錄水平的影響??．４．１?Ｓｐｌ對(duì)ＧＲ轉(zhuǎn)錄水平的影響??

增殖與凋亡等一系列細(xì)胞生理周期過程。當(dāng)機(jī)體不受到外界應(yīng)激的情況下，ｐ５３以一種非活??性的狀態(tài)存在細(xì)胞質(zhì)中，但當(dāng)受到壓力、環(huán)境等應(yīng)激，它的非活性狀態(tài)則轉(zhuǎn)化為活性狀態(tài)，??通過與特異性靶基因結(jié)合的激活來誘導(dǎo)其生物學(xué)作用。ＧＲ與Ｐ５３的負(fù)反饋調(diào)控如圖３所示，??當(dāng)ＧＣ進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，激活與ＧＲ的結(jié)合位點(diǎn)，形成ＧＲ－ＧＣ復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，激活ｐ５３，??相互抑制各自與靶基因結(jié)合的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)也形成ＧＲ－ｐ５３復(fù)合物，通過ＭＤＭ２信號(hào)通路調(diào)控??該復(fù)合物蛋白的降解。此外，ｐ５３還可以通過抑制ｐ５３反應(yīng)元件的選擇特異性基因的表達(dá)來??調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖或凋亡等生ｉ里活性。Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ＿等在海馬上的研究表明，ｐ５３基因的表達(dá)增加．??會(huì)促使ＧＲ基因的表達(dá)下降，說明ｐ５３與ＧＲ存在著拮抗調(diào)節(jié)的關(guān)系。ｐ５３除了對(duì)ＧＲ轉(zhuǎn)錄水??平進(jìn)行抑制外，還抑制ＧＲ的功能例如負(fù)反饋于下丘腦－垂體－腎上腺（ＨＰＡ）軸。ＭｕｒｐｈｙｌｌＭＩ??等研究發(fā)現(xiàn)ｐ５３蛋白通過ＧＣ削弱了炎癥因子ＮＦ－ｋＢ目標(biāo)基因的表達(dá)，而ｐ５３的損傷突變也??削弱糖皮質(zhì)激素受體的轉(zhuǎn)錄靶基因。其他研宄小組報(bào)道

基于ＱＲＴ－ＰＣＲ定量引物的要求較為嚴(yán)格，因此在利用Ｏｌｉｇｏ?７．０并結(jié)合Ｐｒｉｍｅｒ?５．０軟件，??嚴(yán)格按照設(shè)計(jì)引物的各參數(shù)要求，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，之后利用在線網(wǎng)頁ＮＣＢＩ工具進(jìn)行Ｐｒｉｍｅｒ??ｂｌａｓｔ，檢測(cè)引物的特異性，特異性良好之后才能合成。按
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2837988