肌內脂肪含量影響肉質的嫩度、多汁性及風味,如何提高肌內脂滴發(fā)育讓更多的脂質沉積到肌肉中成為生產(chǎn)者及科研工作者共同關注的話題。近年來,隨著多種組學檢測技術的快速發(fā)展,脂滴的純化技術越來越受到關注。分離純化獲得具有生物學活性,并且純度較高的脂滴是保證其生物學功能研究可靠性的前提。本研究分析不同屠宰體重對肉品質的影響,建立豬背最長肌肌內脂滴的超速離心分離純化的方法,并對分離脂滴進行形態(tài)學觀察及純度驗證,為研究豬肌內脂肪生成和分子調控機制提供技術支撐。對研究肌肉中脂質的沉積,改善豬肉品質及食用價值,生產(chǎn)有益于人體健康的肉制品具有重要意義。本試驗結果如下:1.為了研究不同屠宰體重下肌內脂肪含量對豬胴體性狀及肉品質特性的影響,試驗選取90±2.0 kg與120±2.0 kg的“杜×長×大”三元雜交肥育豬屠宰后對其肌內脂肪、肉品質及營養(yǎng)成分分析。結果顯示:120 kg體重與90 kg體重屠宰時相比,1)隨著體重的增加,肌內脂肪含量顯著增加;2)隨著體重的增加120 kg體重屠宰時極顯著的提高了胴體重、背膘厚度、眼肌面積、屠宰率等指標(P0.01)。3)隨著屠宰體重的增加極顯著提高了豬肉肉色(P0.01),降低了失水率和蒸煮損失,顯著提高了肌肉剪切力(P0.05)。4)120 kg體重屠宰時顯著提高了不飽和脂肪酸的含量(P0.05)和顯著降低了飽和脂肪酸的含量(P0.05)。5)隨著體重的增加120kg體重屠宰時顯著提高了必需氨基酸的含量(P0.05),極顯著的提高了鮮味氨基酸的含量(P0.01)。2.為了建立豬背最長肌肌內脂滴分離純化的方法,本研究首次嘗試分離豬肌內脂滴并進行純化的方法。將背最長肌組織樣品進行不同超速離心速度獲得肌內脂滴,經(jīng)過油紅O染色鑒定為形態(tài)完整的油滴。提取脂滴蛋白進行考馬斯亮藍染色鑒定脂滴蛋白的純度較高。然后,通過Western blot技術檢測脂滴中是否存在線粒體、高爾基體、內質網(wǎng)、質膜等細胞器,進一步驗證脂滴純度。結果表明:采用超速離心法分離純化豬背最長肌肌內脂滴,通過形態(tài)學觀察及Western blot技術驗證脂滴純度,表明這種方法能夠分離出純度較高的肌內脂滴。3.為研究豬肌內脂滴蛋白對脂質沉積及分解代謝的調控機制,本試驗以分離純化脂滴為切入點,觀察肌內脂滴的形態(tài)大小及數(shù)量,將提取脂滴蛋白利用Western blot技術檢測調控脂滴代謝的關鍵因子的表達水平。結果表明:隨著育肥豬體重的增加,體重120kg肌內脂滴的體積增大,脂滴內的脂滴代謝相關蛋白極顯著增加。綜上所述,“杜×長×大”三元雜交育肥豬在體重120 kg左右的屠宰時比體重90 kg肌內脂肪含量顯著增加,提高了豬肉肉質性狀及營養(yǎng)價值。采用超速離心法分離純化豬背最長肌肌內脂滴,能夠獲得形態(tài)較好、純度較高的肌內脂滴。隨著育肥豬體重的增加肌內脂滴的體積不斷增大,調控脂滴表面脂質沉積及降解的代謝蛋白也增加,共同調控脂滴的代謝平衡。
【學位單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S828
【部分圖文】：

離心 30 min。離心后上層漂浮的白色物質即為脂滴（ 1.0 mL 用于脂滴蛋白純度的檢測（PNS2）。然后在 4℃，90,清液（PNS3）（圖 4-1 D）。將上層脂滴移入另一個無菌的 4離心管中加入 BufferB，并用移液槍小心吹打聚集成團的脂這樣有利于除去脂滴間夾雜的其他細胞器或胞膜等（圖 4-1C離心 30 min，取 上清液（PNS4）（圖 4-1E）。得到更加純化的脂滴，小心收集上一步驟多次離心的脂滴2PA 離心管中，并且將脂滴在溶液中小心吹打成乳白色。4℃，注意：離心的轉速過高會導致脂滴破碎，速度過低則得不到清液（PNS5）并收集上層漂浮的脂滴，盡量避免抽取下層的 的離心管中（圖 4-1F）。此時，如果脂滴用于觀察形態(tài)置于-4 Western blots 及組學分析則放入-80℃冰箱內保存，防止蛋白

圖 4-2 豬肌內脂滴、油紅 O 染色、BODIPY 染色圖圖 A 為肌內脂滴形態(tài)圖（40×）；圖 B（10×）和 C（40×）油紅 O 染色圖；圖 D （10×）BODIPY熒光染色脂滴形態(tài)圖Figure.4-2 Lipid droplets and oil red O staining and bodipy fluorescence staining profiles ofintramuscular fat in pigsFigure. A Intramuscular lipid droplet profiles (40×); Figure B (10×) and figure C (40×) Oil red Ostaining and figure D bodipy fluorescence staining lipid droplets profiles of intramuscular fat4.4 考馬斯亮藍染色蛋白的鑒定將不同離心力獲得的細胞漿（Cyto）、上清液（PNS1-5）及脂滴（LDs）蛋白由SDS-PAGE 分離蛋白后進行考馬斯亮藍染色。圖 4-3 結果顯示：經(jīng)過多次超速離心后獲得的脂滴蛋白不同于 Cyto 及 PNS 蛋白組成，但是第三次離心獲得的 PNS3 蛋白表達譜開始與 LDs 蛋白相似。LDs 蛋白中包含 5 種主要的蛋白條帶，Image J 分析主要脂滴相關蛋白量近 54.24%。LDs 經(jīng)過 5 次反復清洗、離心，最終獲得的 LDs 蛋白輪廓與 PNS4

熒光染色脂滴形態(tài)圖-2 Lipid droplets and oil red O staining and bodipy fluorescence staintramuscular fat in pigsntramuscular lipid droplet profiles (40×); Figure B (10×) and figured figure D bodipy fluorescence staining lipid droplets profiles of intra藍染色蛋白的鑒定力獲得的細胞漿（Cyto）、上清液（PNS1-5）及脂滴蛋白后進行考馬斯亮藍染色。圖 4-3 結果顯示：經(jīng)過多同于 Cyto 及 PNS 蛋白組成，但是第三次離心獲得的 相似。LDs 蛋白中包含 5 種主要的蛋白條帶，Image 24%。LDs 經(jīng)過 5 次反復清洗、離心，最終獲得的 LDs 輪廓相似，與 Ding（2012）研究結果一致。所以，本已經(jīng)適合進一步的蛋白質組學分析。
【參考文獻】

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本文編號：2835857