我國(guó)具有獨(dú)特和豐富的小型豬資源。其中廣西巴馬小型豬與人相比,其基因組同源性高達(dá)83%,在生理學(xué)、疾病發(fā)生機(jī)理、解剖學(xué)等方面與人類又相似,因此,小型豬是研究人體生理、病理機(jī)制和異種器官移植的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[1]。廣西巴馬小型豬作為具有代表性的實(shí)驗(yàn)用小型豬之一,其具有體型矮小、性成熟較早、生長(zhǎng)速度比大型瘦肉型豬種緩慢的特點(diǎn)。影響動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的因素較多且復(fù)雜,遺傳、營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境以及激素等諸多因素對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控都是通過(guò)神經(jīng)內(nèi)分泌生長(zhǎng)軸(GH-GHR-IGFs)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。有研究表明,廣西巴馬小型豬血清中GHR和IGF-I的濃度極顯著低于杜洛克、約克夏和長(zhǎng)白豬,但血清中GH濃度在4個(gè)品種之間沒(méi)有顯著差異�；虻霓D(zhuǎn)錄是一個(gè)非常關(guān)鍵的階段,它在遺傳信息傳遞的過(guò)程中起著“橋梁”作用。轉(zhuǎn)錄的起始時(shí)間、起始位點(diǎn)和頻率受到啟動(dòng)子這一重要元件的調(diào)控。啟動(dòng)子主要是通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合來(lái)發(fā)揮調(diào)控作用的。為探索豬GHR基因啟動(dòng)子SNP位點(diǎn)與GHR表達(dá)的關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)克隆了 2個(gè)廣西地方豬種和3個(gè)國(guó)外豬種GHR基因啟動(dòng)子序列,篩選地方豬種與國(guó)外豬種差異SNP位點(diǎn),研究差異SNP位點(diǎn)對(duì)GHR表達(dá)的影響,主要的研究結(jié)果如下:1.運(yùn)用PCR擴(kuò)增廣西巴馬小型豬(n=48)、陸川豬(n=28)、長(zhǎng)白豬(n=42)、杜洛克豬(n=45)、大白豬(n=40)GHR基因啟動(dòng)子區(qū)約1300bp序列,測(cè)序后進(jìn)行序列對(duì)比,結(jié)果發(fā)現(xiàn)GHR啟動(dòng)子上游區(qū)-758位點(diǎn),廣西巴馬小型豬和陸川豬均為A,而長(zhǎng)白豬、杜洛克豬和大白豬均為G。應(yīng)用轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)在線預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),該位點(diǎn)是AP-2α轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。2.成功構(gòu)建廣西巴馬小型豬GHR基因啟動(dòng)子核心區(qū)域-758位點(diǎn)突變型(-758 A→G)和野生型(-758 A)雙熒光素酶報(bào)告基因載體,并轉(zhuǎn)染PK15和C2C12細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),廣西巴馬小型豬突變型基因載體的啟動(dòng)子活性顯著高于野生型載體的啟動(dòng)子活性(p0.05)。3.成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄因子AP-2α基因的超表達(dá)載體pcDNA3.1-AP-2α,轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞后定量檢測(cè)細(xì)胞中AP-2α和GHR基因的相對(duì)表達(dá)情況。結(jié)果顯示,超表達(dá)AP-2α基因后,AP-2α基因的相對(duì)表達(dá)量顯著上升(p0.01),GHR基因的相對(duì)表達(dá)量也顯著上升(p0.01)。4.將廣西巴馬小型豬突變型(-758 A→G)和野生型(-758 A)GHR基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因載體與轉(zhuǎn)錄因子超表達(dá)載體pcDNA3.1-AP-2α共轉(zhuǎn)PK15細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),廣西巴馬小型豬GHR基因啟動(dòng)子突變型載體和pcDNA3.1-AP-2α共轉(zhuǎn)組(實(shí)驗(yàn)組)的啟動(dòng)子活性顯著高于廣西巴馬小型豬突變載體和pcDNA3.1共轉(zhuǎn)組(對(duì)照組)(p0.05);廣西巴馬小型豬野生型載體和pcDNA3.1-AP-2α共轉(zhuǎn)組(實(shí)驗(yàn)組)的啟動(dòng)子活性也顯著高于廣西巴馬小型豬野生型載體和pcDNA3.1共轉(zhuǎn)組(對(duì)照組)(p0.05)。AP-2α過(guò)表達(dá)上調(diào)突變型(-758A→G)啟動(dòng)子的活性的程度顯著高于野生型(-758 A)(p0.01)。5.針對(duì)豬PK15腎細(xì)胞,設(shè)計(jì)了 5個(gè)shRNA載體用于內(nèi)源性AP-2αα基因表達(dá)的干擾實(shí)驗(yàn)。shRNA載體轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞后定量檢測(cè)AP-2α基因和GHR基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,干擾AP-2α基因表達(dá)后,AP-2α基因的表達(dá)量顯著下降(p0.01),GHR基因的表達(dá)量也顯著下降(p0.01)。6.針對(duì)廣西巴馬小型豬GHR基因啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄因子AP-2α結(jié)合位點(diǎn)的DNA堿基序列,設(shè)計(jì)了相應(yīng)的生物素標(biāo)記探針、冷競(jìng)爭(zhēng)性探針和突變探針并進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)。EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄因子AP-2α能與所設(shè)計(jì)的探針相結(jié)合,證明轉(zhuǎn)錄因子AP-2α能夠靶向GHR基因啟動(dòng)子上其相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S828
【部分圖文】：

所有成員在其Ｃ－末端都具有高度保守的螺旋－跨越－螺旋（ＨＳＨ）邋ＤＮＡ結(jié)合和二聚化結(jié)逡逑構(gòu)域，并且在其Ｎ－末端具有較不保守的富含脯氨酸和富含谷氨酰胺的反式激活結(jié)構(gòu)域＾逡逑（如圖１－１所示）。大多數(shù)異構(gòu)體在Ｎ－末端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域中也具有ＰＹ基序（ＸＰＰＸＹ），逡逑這對(duì)于它們作為轉(zhuǎn)錄激活因子的作用是重要的［６氣ＡＰ－２因子只有形成同源二聚體或異逡逑二聚體才有調(diào)控轉(zhuǎn)錄的活性。螺旋－跨越－螺旋基序與基本區(qū)域一起介導(dǎo)ＤＮＡ結(jié)合逡逑脯氨酸和谷氨酰胺酸區(qū)負(fù)責(zé)反式激活。在各種細(xì)胞和病毒增強(qiáng)子中，ＡＰ－２結(jié)合到回文逡逑共識(shí)序列Ｓｉ－ＧＣＣｌ＾ＧＧＣＧ’ＷＭ；在體外的結(jié)合位點(diǎn)選擇實(shí)驗(yàn)揭示另外的結(jié)合序列逡逑５，－ＧＣＣＮ３ＧＧＣ－３，，５，－ＧＣＣＮ４ＧＧＣ－３＇和邋Ｓ＇－ＧＣＣＮＭＧＧＧｄ６３，６４］。與這些序列基序不同逡逑的其它結(jié)合位點(diǎn)，例如ＳＶ４０增強(qiáng)子元件５＇－ＣＣＣＣＡＧＧＣ－３＠５】，表明ＡＰ－２蛋白可能與逡逑一系列具有可變親和力的富含Ｇ／Ｃ的元件結(jié)合。在其啟動(dòng)子序列中具有ＡＰ－２結(jié)合位點(diǎn)逡逑的靶基因參與諸如細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的生物過(guò)程，并且包括例如編碼胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)逡逑合蛋白５邋（邋ＩＧＦＢＰ５邋）結(jié)合位點(diǎn)５＇－ＧＣＣＡＧＧＧＧＣ－３＿］，前胸腺激素ａ逡逑（５，－ＧＣＣＧＧＴＧＧＧＣ－３，）［６７］，雌激素受體（５，－ＧＣＣＴＧＣＧＧＧＧ－３，）［６８］。逡逑７逡逑

的廣西巴馬小型豬ＧＨＲ基因啟動(dòng)子序列為模板，利用Ｐｒｉｍｏｅｒ邋５．０和Ｏｉｉｇｏ７軟件設(shè)計(jì)３逡逑對(duì)引物，對(duì)在啟動(dòng)子上面的轉(zhuǎn)錄因子ＡＰ－２ａ結(jié)合位點(diǎn)序列進(jìn)行定點(diǎn)突變，引物序列詳逡逑細(xì)信息如表２－１所示，定點(diǎn)突變流程圖，如圖２－１所示，引物由華大基因合成。逡逑１２逡逑

２．３．１基因組ＤＮＡ的提取逡逑用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)豬基因組ＤＮＡ樣品的濃度，將檢測(cè)合格的樣品進(jìn)行１％瓊逡逑脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖２－１所示，泳道內(nèi)的基因組ＤＮＡ樣品條帶明亮單一無(wú)雜帶，逡逑可做為后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需。逡逑圖２－２豬基因組ＤＮＡ電泳圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｐｏｒｃｉｎｅ邋ｇｅｎｏｍｉｃ邋ＤＮＡ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｍａｐ逡逑２４逡逑

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