豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)感染引起的豬的病毒性傳染病,其典型癥狀與病理特征為高熱、全身組織彌散性出血。豬瘟有較高的感染性和致死率,所以給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,也成為困擾養(yǎng)豬業(yè)的難題。豬瘟病毒為單股正鏈RNA病毒,屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)成員。與其他瘟病毒屬成員一樣,CSFV在體內(nèi)能快速增殖,并給宿主動物造成致死性傷害,但是體外細(xì)胞培養(yǎng)的豬瘟病毒,能在宿主細(xì)胞中持續(xù)感染并不產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。病毒作為一種嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生生物,其復(fù)制增殖和培養(yǎng)特點(diǎn)很大程度取決于宿主細(xì)胞對病毒的抵抗以及病毒對細(xì)胞生理機(jī)制的逃避和調(diào)控。因此,探究病毒與細(xì)胞生理活動之間的關(guān)系,對于更清楚地了解病毒的致病機(jī)理有重要意義。細(xì)胞自噬(autophagy)是廣泛存在于真核生物中維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種生理現(xiàn)象。在真核細(xì)胞中,當(dāng)細(xì)胞遭遇環(huán)境壓力如饑餓、能量需求或者病原微生物侵襲時,細(xì)胞自噬會迅速發(fā)生。自噬通過溶酶體對細(xì)胞內(nèi)的衰老細(xì)胞器、長壽命蛋白以及外源病原微生物進(jìn)行吞噬和降解,其降解產(chǎn)物重新被細(xì)胞利用,用于重新合成蛋白質(zhì)以維護(hù)細(xì)胞器功能及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等。此外,自噬還具有清除感染細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌和病毒的重要功能。但是近年來越來越多的報道表明,很多病毒并沒有被細(xì)胞自噬機(jī)制抵制,反而利用自噬過程為病毒自身的復(fù)制增殖服務(wù)。這種看似違背常理的現(xiàn)象背后究竟隱藏著什么“秘密”,正是近年來人們研究的熱點(diǎn)之一。為了探究CSFV在豬睪丸細(xì)胞系(swine testicles,ST)中與細(xì)胞自噬的關(guān)系,我們開展了研究工作,獲得了以下結(jié)果:(1)CSFV對細(xì)胞自噬機(jī)制的影響。豬瘟病毒石門株(CSFV Shimen株)感染ST細(xì)胞后,通過透射電鏡、MDC染色、LC3熒光觀察,以及自噬相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平的Western blot檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),豬瘟病毒能誘導(dǎo)ST細(xì)胞自噬體雙層膜結(jié)構(gòu)的形成,并使GFP-LC3在細(xì)胞內(nèi)形成聚點(diǎn),上調(diào)自噬相關(guān)基因Beclin-1和LC3的表達(dá),說明CSFV的感染能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。CSFV感染后能顯著促進(jìn)自噬溶酶體底物蛋白p62的降解,但是氯喹(CQ)阻斷自噬溶酶體形成后,CSFV的感染卻顯著上調(diào)了p62蛋白的表達(dá)。說明CSFV能誘導(dǎo)自噬溶酶體的形成,促進(jìn)完整的自噬過程。紫外線滅活的病毒孵育后0.5 h能誘導(dǎo)自噬,但是后期卻不能誘導(dǎo)自噬,說明病毒的吸附階段能誘導(dǎo)自噬,然而持續(xù)自噬的誘導(dǎo)則需要病毒的復(fù)制過程。(2)CSFV蛋白對細(xì)胞自噬機(jī)制的影響。構(gòu)建了CSFV的各個結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞后檢測各蛋白對ST細(xì)胞自噬的影響,通過熒光定量PCR和Western blot檢測自噬相關(guān)基因核酸和蛋白水平表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),CSFV結(jié)構(gòu)蛋白E1、非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B上調(diào)了自噬相關(guān)基因Beclin-1和LC3的表達(dá),并促進(jìn)了p62蛋白的降解。而非結(jié)構(gòu)蛋白NS2和NS3上調(diào)Beclin-1和LC3的表達(dá),卻對p62蛋白的表達(dá)沒有顯著影響。說明E1、NS4B誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生,并促進(jìn)了完整的細(xì)胞自噬反應(yīng),NS2和NS3誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生,但是并未誘導(dǎo)完整的自噬過程。(3)自噬對CSFV復(fù)制的影響。利用自噬促進(jìn)劑Rapamycin,自噬抑制劑3MA,以及自噬流阻斷劑CQ調(diào)控細(xì)胞自噬機(jī)制,從而研究細(xì)胞自噬對CSFV增殖的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)自噬發(fā)生或者阻斷自噬流均促進(jìn)了CSFV的復(fù)制,而抑制自噬的發(fā)生則抑制了病毒復(fù)制,并且對自噬的調(diào)控在病毒感染之前對病毒的復(fù)制有顯著的影響。進(jìn)一步通過特異性干擾自噬基因,也證實(shí)抑制自噬過程不利于病毒復(fù)制。這就說明,自噬的發(fā)生,尤其是自噬體結(jié)構(gòu)的形成能夠促進(jìn)病毒的增殖。(4)自噬在CSFV感染ST細(xì)胞中對細(xì)胞周期與增殖的影響。通過細(xì)胞增殖檢測、流式細(xì)胞術(shù)、周期蛋白的定量分析以及DNA合成分析試驗(yàn)來檢測自噬在CSFV感染中對細(xì)胞周期和增殖的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),CSFV感染ST細(xì)胞后,可引起S期細(xì)胞比例增加,細(xì)胞DNA合成增加,但是并未對細(xì)胞增殖產(chǎn)生明顯影響。而在干擾掉自噬基因的細(xì)胞株中,CSFV的感染抑制了細(xì)胞增殖,細(xì)胞DNA合成受阻,細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。說明細(xì)胞自噬參與了病毒對細(xì)胞周期的調(diào)控。綜上所述,本研究明確了CSFV感染可誘導(dǎo)ST細(xì)胞自噬,并促進(jìn)完整的自噬過程;CSFV的E1蛋白和NS4B蛋白可誘導(dǎo)完整的自噬過程,NS2和NS3蛋白可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生,但不能引起完整的自噬流;自噬過程有利于CSFV的復(fù)制;自噬參與了CSFV對細(xì)胞周期和增殖的調(diào)控。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S852.651
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
文獻(xiàn)綜述
    第一章 豬瘟病毒研究進(jìn)展
        1.1 病原學(xué)研究概述
            1.1.1 CSFV結(jié)構(gòu)以及生物學(xué)特性
            1.1.2 豬瘟病毒基因組結(jié)構(gòu)及編碼蛋白的生物學(xué)功能
        1.2 流行病學(xué)
            1.2.1 易感動物
            1.2.2 傳播途徑
            1.2.3 豬瘟病毒的進(jìn)化分群
    第二章 細(xì)胞自噬研究進(jìn)展
        2.1 自噬的分類
            2.1.1 大分子自噬
            2.1.2 小分子自噬
            2.1.3 分子伴侶自噬
        2.2 細(xì)胞自噬研究方法
            2.2.1 自噬的靜態(tài)檢測
            2.2.2 自噬動態(tài)過程檢測技術(shù)
        2.3 細(xì)胞自噬與病毒感染的相互作用
            2.3.1 病毒誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的機(jī)制
            2.3.2 細(xì)胞自噬的抗病毒作用
            2.3.3 病毒利用細(xì)胞自噬促進(jìn)自身增殖
            2.3.4 病毒抑制細(xì)胞自噬
            2.3.5 自噬與病毒相互抗衡
            2.3.6 病毒增殖與自噬無關(guān)
試驗(yàn)研究
    第三章 豬瘟病毒感染ST細(xì)胞誘導(dǎo)自噬的發(fā)生
        3.1 材料
            3.1.1 細(xì)胞、病毒與質(zhì)粒
            3.1.2 主要試劑、抗體及試劑盒
            3.1.3 主要儀器設(shè)備
        3.2 方法
            3.2.1 主要溶液配制
            3.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與豬瘟病毒的擴(kuò)增及其感染復(fù)數(shù)的確定
            3.2.3 GFP-LC3B質(zhì)粒的擴(kuò)增與鑒定
            3.2.4 ST細(xì)胞接種豬瘟病毒與病毒增殖定量PCR檢測
            3.2.5 透射電鏡觀察自噬體
            3.2.6 MDC染色觀察自噬體
            3.2.7 GFP-LC3B轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測病毒對LC3 的影響
            3.2.8 Western blot檢測自噬相關(guān)基因
            3.2.9 CSFV誘導(dǎo)細(xì)胞自噬流的檢測
            3.2.10 滅活的病毒對細(xì)胞自噬的影響
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 GFP-LC3B質(zhì)粒的酶切鑒定
            3.3.2 豬瘟病毒在ST細(xì)胞中增殖檢測
            3.3.3 MDC染色CSFV感染ST細(xì)胞
            3.3.4 透射電鏡觀察CSFV感染ST細(xì)胞后誘導(dǎo)自噬體結(jié)構(gòu)形成
            3.3.5 CSFV感染ST細(xì)胞后誘導(dǎo)GFP-LC3 熒光聚點(diǎn)的形成
            3.3.6 CSFV感染ST細(xì)胞后引起自噬相關(guān)蛋白的變化
            3.3.7 CSFV感染ST細(xì)胞后誘導(dǎo)了完整的自噬反應(yīng)
            3.3.8 紫外線滅活病毒后Western blot檢測LC3 的轉(zhuǎn)化
        3.4 討論
        3.5 小結(jié)
    第四章 豬瘟病毒編碼蛋白對細(xì)胞自噬的影響
        4.1 材料
            4.1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒
            4.1.2 主要試劑、抗體及試劑盒
            4.1.3 主要儀器設(shè)備
        4.2 方法
            4.2.1 主要溶液配制
            4.2.2 真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞
            4.2.3 表達(dá)蛋白的鑒定
            4.2.4 CSFV蛋白對自噬相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響
            4.2.5 CSFV蛋白對自噬相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平的影響
        4.3 結(jié)果
            4.3.1 真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞
            4.3.2 表達(dá)蛋白的鑒定
            4.3.3 CSFV蛋白對自噬相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響
            4.3.4 CSFV蛋白對自噬相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平的影響
        4.4 討論
        4.5 小結(jié)
    第五章 細(xì)胞自噬對豬瘟病毒復(fù)制的影響
        5.1 材料
            5.1.1 細(xì)胞、病毒與質(zhì)粒
            5.1.2 主要試劑、抗體及試劑盒
            5.1.3 主要儀器設(shè)備
        5.2 方法
            5.2.1 主要緩沖液及試劑配制
            5.2.2 CCK-8 試驗(yàn)檢測藥物對ST細(xì)胞的影響
            5.2.3 病毒感染與藥物處理
            5.2.4 shRNA的轉(zhuǎn)染與穩(wěn)轉(zhuǎn)篩選
            5.2.5 基因干擾效果的鑒定
            5.2.6 干擾自噬基因?qū)ωi瘟病毒復(fù)制的影響
        5.3 結(jié)果
            5.3.1 CCK-8 試驗(yàn)檢測藥物對ST細(xì)胞的影響
            5.3.2 自噬激活劑Rapamycin促進(jìn)了病毒增殖
            5.3.3 自噬抑制劑 3MA降低了病毒增殖
            5.3.4 自噬流阻斷劑CQ有利于病毒增殖
            5.3.5 不同加藥方式對病毒增殖的影響
            5.3.6 自噬基因LC3、ATG7、Beclin-1 的干擾以及鑒定
            5.3.7 干擾自噬基因?qū)SFV增殖的影響
        5.4 討論
        5.5 小結(jié)
    第六章 自噬參與CSFV對ST細(xì)胞周期和增殖的調(diào)控
        6.1 材料
            6.1.1 細(xì)胞、病毒與質(zhì)粒
            6.1.2 主要試劑及試劑盒
            6.1.3 主要儀器設(shè)備
        6.2 方法
            6.2.1 主要緩沖液及試劑的配制
            6.2.2 干擾自噬基因細(xì)胞株的獲得
            6.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期
            6.2.4 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖
            6.2.5 BrdU染色檢測細(xì)胞DNA
            6.2.6 定量PCR檢測周期調(diào)節(jié)蛋白轉(zhuǎn)錄水平
        6.3 結(jié)果
            6.3.1 CSFV感染ST細(xì)胞對細(xì)胞周期的影響
            6.3.2 CSFV感染ST細(xì)胞對細(xì)胞增殖的影響
            6.3.3 CSFV對自噬基因缺陷細(xì)胞周期的影響
            6.3.4 CSFV對自噬基因缺陷細(xì)胞增殖的影響
        6.4 討論
        6.5 小結(jié)
結(jié)論
本文的創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
縮略詞
致謝
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【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 馬泰;孫國平;李家斌;;細(xì)胞自噬的研究方法[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2012年03期

2 陳曦;梁文穎;熊靜波;;自噬的檢測方法及評述[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2012年09期

本文編號：2829239