豬流行性感冒(Swine influenza,SI)是由A型流感病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性感染的呼吸道傳染病。其臨床癥狀為突然發(fā)病、咳嗽、噴嚏、流涕、呼吸困難、發(fā)熱、衰竭、食欲下降和生長緩慢等。該病發(fā)病率高、傳染性強(qiáng),單純感染時(shí)死亡率并不高,但在短時(shí)間內(nèi)可波及全群,對豬的生長性能造成不良的影響;若與其他病原混合感染,會使死亡率增高,給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前對于豬流感的防控主要通過免疫接種進(jìn)行,但我國市場上豬流感疫苗的種類非常少,且交叉保護(hù)力不強(qiáng)。本研究通過分離國內(nèi)流行的H3N2亞型豬流感病毒,針對滅活劑及佐劑進(jìn)行優(yōu)化,并制備成滅活疫苗,同時(shí)對該滅活疫苗進(jìn)行免疫效力的評估,以提供一種安全有效的豬流感滅活疫苗,減少本病對養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失。本研究從黑龍江省某豬場采集的疑似豬流感發(fā)病豬的鼻拭子13份,經(jīng)過處理后,接種至10~11日齡SPF雞胚,分離到一株具有血凝性的病毒。通過血清學(xué)鑒定、分子生物學(xué)鑒定、電鏡觀察、生物學(xué)特性及理化特性等方法對該病毒進(jìn)行鑒定,結(jié)果可見分離株對雞紅細(xì)胞的凝集價(jià)為1:256,且僅能被H3亞型豬流感陽性血清中和,RT-PCR鑒定結(jié)果為H3、N2亞型;電鏡下病毒粒子呈球形,直徑約為80~120nm,有囊膜,表面有刺突和纖突,對雞胚的半數(shù)感染量(EID_(50))為10~(-6.38)EID_(50)/0.1mL;該病毒對熱、氯仿以及乙醚均敏感;從上述對病毒特性的研究,判定分離的病毒為H3N2亞型豬流感病毒。利用10~11日齡SPF雞胚制備制苗用病毒液,用終濃度為0.2%二乙烯亞胺(BEI)滅活病毒,將其乳化制成油乳劑滅活疫苗,用血清學(xué)方法和免疫攻毒方法對該疫苗的免疫效力進(jìn)行評估,并測定了疫苗的免疫期。結(jié)果可見該滅活疫苗的免疫效力良好,與市售豬流感滅活疫苗比較,可見兩者免疫期相同,且本疫苗的免疫效力在一定程度上優(yōu)于市售疫苗。由此可見該毒株可以作為一株優(yōu)質(zhì)的制苗用備選毒株,為豬流感疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.4
【部分圖文】：

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)碩士學(xué)位論文ine/ACheng/5/2016(H3N2)[24]。豬流感病毒（Swine influenza Virus，SIV）粒子呈多形性，在初次分離時(shí)為絲狀，一，經(jīng)雞胚培養(yǎng)傳代后均呈球狀，直徑約為 80～120 nm[25,26]。病毒具有囊膜，囊膜定病毒吸附紅細(xì)胞功能的血凝素（haemagglutinin，HA）和幫助新病毒粒子從細(xì)胞來的神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）兩種刺突狀糖蛋白以及跨膜的基質(zhì)蛋白（ins，M2）組成，HA 約為 NA 的 4～5 倍[27]�；|(zhì)蛋白 M1 位于囊膜類脂雙層內(nèi)側(cè)外側(cè)，以維持病毒形態(tài)。病毒的核衣殼由核蛋白（nucleoprotein, NP）構(gòu)成，其內(nèi)含 RNA、三種聚合酶蛋白（PB1、PB2、PA）以及非結(jié)構(gòu)蛋白（nonstructural proteinsPB2、PA 的分子質(zhì)量在流感病毒各亞單位蛋白中是最大的，且在被感染的細(xì)胞的，均發(fā)現(xiàn)了 PA、PB2 和 PB1 成分。NS 由 NS1 和 NS2 組成，當(dāng)病毒感染細(xì)胞后，檢出大量 NS1、胞漿內(nèi)可檢出大量 NS2，但病毒粒子中則不再存在[28-32]。病毒基本圖見圖 1-1[33]。

好的病料上清液，接種于 10~11 日齡 SPF 雞胚，接種量為 0.2ml/胚，35℃持為 60~65%）培養(yǎng)，每日檢胚 2 次，棄去 24h 內(nèi)死亡的雞胚，24h 后死亡至 72h 取出全部雞胚，置 2~8℃冷卻 12h，收獲雞胚尿囊液，進(jìn)行紅細(xì)胞 份病料接種的雞胚盲傳 2 代時(shí)，收獲的雞胚尿囊液出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集，效價(jià)為釋法接種 10~11 日齡雞胚檢測半數(shù)雞胚感染量為 10-5.68EID50/0.1ml，結(jié)果見的胚體出現(xiàn)水腫、出血點(diǎn)等病理變化，結(jié)果見圖 3-1。表 3-1 病毒 EID50測定結(jié)果Tab .3-1 Results of virus EID50measurement度tion接種雞胚數(shù)Inoculation holesCPE+CPE－積累Accumulation CPE 率百分PerceCPE+CPE－5 5 0 11 0 11/11 105 4 1 6 1 6/7 855 2 3 2 4 2/6 335 0 5 0 9 0/9 0

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)碩士學(xué)位論文明所分離的毒株為 H3 亞型豬流感病毒，并將該分離株命名為 AC 株。表 3-2 紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)鑒定結(jié)果Tab.3-2 The indentification result of Hemagglutination inhibition test代次generation陽性抗血清Positive antiserumH1 H3 H5 H9F5 - + - -注：“+”陽性反應(yīng)；“-”陰性反應(yīng)Note:“+”positive reaction, “-”negative reaction..2.2 病毒的分子生物學(xué)鑒定將豬流感病毒 AC 株用所合成的引物進(jìn)行流感病毒亞型的鑒定。由圖 3-2, 3-3 可以看出 H3 U/L、和 N2 U/L 擴(kuò)增出了與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致的條帶，表明該樣品的 HA 為 H3型，NA 為 N2 亞型。

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本文編號：2829114