脂肪組織既是一個儲能器官,也是一個重要的內(nèi)分泌器官。脂肪組織的形成主要包括脂肪生成和脂肪蓄積兩個事件。脂肪過厚不僅影響豬的生長速度、飼料效率和胴體品質(zhì),而且影響豬的繁殖性能并對全身性代謝產(chǎn)生影響。因此,從脂肪細胞生成和脂質(zhì)代謝兩個角度去闡明脂肪組織形成的機制,并探索體脂沉積的營養(yǎng)調(diào)控技術(shù)是目前研究的熱點問題之一。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),妊娠期母豬過肥時,顯著增加了弱仔的比率。因此,解析妊娠期母豬過肥時弱仔發(fā)生的具體機制及妊娠期母體的脂肪發(fā)育與代謝的調(diào)節(jié)機制具有重要意義。過去二十多年的研究發(fā)現(xiàn),脂肪細胞生成受到了高度復(fù)雜且精密的轉(zhuǎn)錄級聯(lián)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控,核受體過氧化物酶增殖子激活受體γ(Peroxisome Proliferator Activated Receptorγ,PPARγ)是調(diào)控成脂分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,能響應(yīng)長鏈多不飽和脂肪酸,發(fā)揮促進成脂分化、胎盤形成和血管生成等重要的生物學功能。近年來的研究發(fā)現(xiàn),細胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體120(G protein coupled receptor 120,GPR120)也具有響應(yīng)LCPUFA促進成脂分化的作用,但其調(diào)控機制不明。那么,細胞膜上GPR120被激活后,是通過什么信號傳導(dǎo)途徑傳入細胞核中的?這些信號是怎樣激活PPARγ從而促進成脂分化的?另外,妊娠期母體肥胖條件下,GPR120和PPARγ的表達是否受到影響,并引發(fā)胎盤功能異常,這些重要的問題都值得深入研究。因此,本研究以妊娠期不同背膘母豬為研究對象,探討妊娠期母體過肥影響低初生重(Low Birth Weight,LBW)仔豬(下稱弱仔)發(fā)生的機制,揭示GPR120等關(guān)鍵基因的正常表達對于胎盤功能的影響;并闡明GPR120通過PPARγ調(diào)控脂肪分化的機制。第一部分母豬妊娠肥胖對胎盤發(fā)育的影響及其機制研究1、選擇1090頭胎次為1-4胎的長大二元雜母豬在妊娠109天度量了P2背膘厚。按照背膘厚分為3組,即≤17mm(第1組),18-20mm(第2組),≥21mm(第3組),統(tǒng)計并分析了三組間弱仔發(fā)生率的情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn):三組背膘不同的母豬中,第3組中仔豬初生重≤0.9kg和≤1.0kg的發(fā)生率分別是7.1%和11.51%,顯著高于其他兩組(P0.01)。2、采集了21頭母豬的150份胎盤組織樣品(三組分別是8頭,56份胎盤;5頭,38份胎盤;8頭,56份胎盤),保證胎盤與胎兒一一對應(yīng)。通過分析胎盤組織中甘油三酯發(fā)現(xiàn),第3組顯著高于第二組(P0.05),相比于第1組有升高的趨勢。胎盤的血管發(fā)育和血管發(fā)育關(guān)鍵基因PPARγ和血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)的表達并沒有顯著差異。值得注意的是:我們進一步分析發(fā)現(xiàn),三組背膘下,LBW仔豬的胎盤及血管發(fā)育的關(guān)鍵基因PPARγ和VEGFA表達均顯著低于其他2組;相對于其他兩組,胎盤組織中PPARγ和VEGFA蛋白表達水平也顯著下調(diào)。通過建立了高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法檢測胎盤組織的6-甲基腺嘌呤(m6A)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn):LBW仔豬胎盤中m6A水平顯著高于其他各組(P0.01);m6A去甲基化酶FTO的蛋白水平顯著低于其他各組(P0.01),而m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3表達沒有發(fā)生相應(yīng)的變化;對應(yīng)的FTO和METTL3的基因表達卻沒有受到影響。通過建立了Me RIP-QPCR方法,結(jié)果表明:第3組LBW仔豬胎盤中PPARγ和VEGFA mRNA上m6A甲基化水平顯著升高(P0.01)。這些結(jié)果表明:在不同母體背膘下,背膘過厚的母豬LBW仔豬的形成,可能增加PPARγ和VEGFA mRNA上高m6A修飾水平,從而抑制其基因和蛋白的表達,引發(fā)弱仔胎盤血管發(fā)育障礙。這暗示肥胖母體和正常母體下,LBW仔豬發(fā)生原因可能并不相同。3、把第3組母豬(背膘≥21mm)的仔豬,按照初生重分為4組,即1.0kg,1.0-1.4kg,1.4-1.6kg,1.6kg。結(jié)果發(fā)現(xiàn):仔豬初生重1.0kg的胎盤血管密度顯著低于正常體重組;胎盤組織胎盤脂質(zhì)代謝相關(guān)的GPR120、ABHD5以及胎盤發(fā)育與血管生成相關(guān)的PPARγ、VEGFA的基因和蛋白的表達顯著低于其他組(P0.01),但對應(yīng)這些基因的mRNA m6A水平顯著高于其他各組(P0.01),且胎盤組織中m6A水平與仔豬體重呈現(xiàn)顯著的負相關(guān);而m6A去甲基化酶FTO的蛋白水平顯著低于其他各組(P0.01)。這些結(jié)果表明:在母豬妊娠期體脂過度沉積時,母豬胎盤脂質(zhì)代謝以及胎盤發(fā)育相關(guān)基因mRNA上的m6A修飾程度增加,降低了這些基因在胎盤組織中的表達,最終影響了胎盤血管生成。因此,如何調(diào)節(jié)母豬妊娠期脂肪沉積尤為關(guān)鍵,以下兩部分內(nèi)容基于GPR120探討調(diào)控母豬脂肪分化的作用機制。第二部分,豬GPR120不同轉(zhuǎn)錄本的鑒定及受體信號研究本研究通過克隆豬GPR120基因(pig GPR120,p GPR120),首次鑒定出p GPR120存在3種轉(zhuǎn)錄本,其中p GPR120的野生型(p GPR120 wild type,p GPR120-WT)是主要表達的亞型,在腸道、脾臟和成熟脂肪組織中高表達,并在母豬胎盤和血管內(nèi)皮細胞中表達。接著,通過構(gòu)建GPR120下游經(jīng)典信號胞內(nèi)鈣離子信號([Ca2+]i)報告基因系統(tǒng)和胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular Signal-Regulated Kinase,ERK1/2)報告系統(tǒng),利用雙熒光素酶報告系統(tǒng),鑒定出p GPR120-WT可以很好的響應(yīng)n-3 PUFA,如二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、α-亞麻酸(ALA)以及GPR120特異性激動劑TUG-891的刺激,而其他轉(zhuǎn)錄本受體不能被激活。n-3 PUFA也可以通過p GPR120-WT激活ERK1/2信號,上調(diào)ERK1/2的磷酸化水平。另外,利用上述兩個報告基因系統(tǒng)開展受體顯性抑制實驗,結(jié)果表明,其他突變亞型并不能抑制p GPR120-WT的活性。第三部分GPR120調(diào)控脂肪分化的功能及機制研究1、采用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基MDI對小鼠3T3L1前脂肪細胞進行分化誘導(dǎo),收集0、0.5、1、2、4、6和8天的樣品,QPCR檢測了成脂關(guān)鍵基因的表達模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn):隨著誘導(dǎo)的時間延長,GPR120、PPARγ和脂肪細胞脂肪酸結(jié)合蛋白4(FABP4,也稱為a P2)的表達顯著上調(diào)。豬脂肪組織血管基質(zhì)細胞經(jīng)MDI誘導(dǎo)后也呈現(xiàn)相似的結(jié)果。特別是在誘導(dǎo)兩天之后,GPR120的表達顯著上調(diào)。隨后,在3T3L1細胞中,通過慢病毒干擾GPR120,油紅O染色顯著抑制脂肪分化;相應(yīng)的,成脂相關(guān)基因PPARγ和a P2的表達也顯著下調(diào)。2、用α-亞麻酸ALA和GPR120的特異性激動劑TUG-891分別處理MDI誘導(dǎo)2天的3T3L1細胞后,均顯著增強PPARγ蛋白的表達,從而促進了成脂分化。當慢病毒干擾GPR120的表達后,ALA和TUG-891的處理并不能提高PPARγ的表達,也不影響脂肪分化的表型。利用PPARγ結(jié)合元件報告基因(PPARγResponse Element,PPRE)研究發(fā)現(xiàn),ALA和TUG-891激活PPARγ是依賴于GPR120的。3、作為GPR120的另一種內(nèi)源性激動劑,DHA也可以激活PPRE的活性,卻抑制PPARγ的表達,從而抑制成脂分化的發(fā)生。4、為排除ALA脂肪酸本身對其他事件的影響,我們利用TUG-891研究下游信號通路,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TUG-891可以很好的激活下游的[Ca2+]i-ERK1/2信號;當慢病毒干擾GPR120之后,TUG-891對上述信號的激活作用消失。5、進一步研究[Ca2+]i-ERK1/2信號在脂肪分化中的作用,TUG-891的處理可以上調(diào)成脂關(guān)鍵基因PPARγ和a P2的表達,并上調(diào)PPARγ蛋白的表達,從而促進脂肪分化。當添加[Ca2+]i-ERK1/2信號相應(yīng)的抑制劑,BAPTA-AM和U0126處理時候,可以顯著抑制TU-891對脂肪分化事件的激活作用。在不表達GPR120的HEK293T細胞,利用PPRE活性研究也證實了TUG-891通過[Ca2+]i-ERK1/2信號激活PPARγ,這一過程依賴于GPR120。綜上所述,本研究的主要結(jié)論是:(1)母豬妊娠期肥胖顯著增加仔豬弱仔發(fā)生率,其機制是:母體過度沉積體脂時,胎盤脂質(zhì)沉積增加,導(dǎo)致胎盤組織中去甲基化酶FTO表達水平下調(diào),胎盤RNA m6A修飾水平顯著升高,從而抑制了血管生成關(guān)鍵基因GPR120、ABHD5、PPARγ和VEGF-A的表達,造成胎盤血管發(fā)育障礙,胎兒發(fā)育受阻。(2)豬GPR120參與了脂肪細胞生成的調(diào)控,其機制是:膜受體p GPR120被配基激活后,通過[Ca2+]i-ERK1/2信號通路,上調(diào)了細胞核中核受體PPARγ的表達,從而促進了脂肪分化。
【學位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S828
【部分圖文】：

圖 2-5 妊娠末期不同背膘母豬中 LBW 豬胎盤中關(guān)鍵基因上 m6A 修飾水平n=3，a, b 同行數(shù)據(jù)無相同字母者表示差異顯著（P< 0.05）。箭頭表示胎盤中的血管。Fig. 2-5 Specific m6A modification level increased in the key genesn=3. a, b letters within a row denote statistical difference between means, P< 0.05.3.2 母豬妊娠期末期背膘過厚對不同體重仔豬胎盤發(fā)育的影響3.2.1 母豬妊娠末期背膘過厚對不同體重仔豬胎盤血管發(fā)育的影響實驗室前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)母豬背膘過厚是造成胎盤代謝異常的關(guān)鍵因素，因此，進一步分析妊娠末期背膘過厚母豬不同體重仔豬間的胎盤發(fā)育情況，如圖2-6所示。結(jié)果表明，相比于其他體重的仔豬，LBW 組（體重<1.0kg 組）的仔豬胎盤中，脂質(zhì)代謝相關(guān)基因 ABHD5，顯著低于其他各組，長鏈脂肪酸感受體 GPR120 表達有下降的趨勢，脂肪酸水解酶 ATGL 組間無差異。血管發(fā)育相關(guān)的 VEGFA、PPARγ 顯著低于其他各組，血管生成負調(diào)控因子 Angpt2 組間無差異。值得注意的是，LBW 組仔

GPR120 對肥胖母豬胎盤發(fā)育的影響及其參與脂肪分化調(diào)控的機制3.2.2 母豬妊娠期不同背膘下不同體重仔豬胎盤中 m6A 水平差異我們利用上述實驗中建立的 LC-MS/MS方法檢測了不同仔豬胎盤中m6A 修飾水平的變化，如圖 2-7 所示。結(jié)果表明，LBW 仔豬胎盤中 m6A 水平顯著高于其他各組，m6A 修飾水平與小豬體重之間存在顯著的負相關(guān)。

圖 2-9 妊娠末期背膘過厚母豬不同體重仔豬胎盤中關(guān)鍵基因上 m6A 修飾水平n=3, a, b 同行數(shù)據(jù)無相同字母者表示差異顯著（P< 0.05）。Fig. 2-9 Specific m6A modification level increased in the mRNA of the key genen=3 and a, b letters within a row denote statistical difference between means, P< 0.0豬妊娠末期背膘厚度對低初生重仔豬發(fā)生率的影響持母豬最佳體況對提高繁殖性能至關(guān)重要（Kim et al 2013）。在本研究了背膘過厚組 LBW 豬的百分比顯著增加。因此，我們進一步關(guān)注三 LBW 豬的發(fā)生。與其他組相比，母體肥胖的 LBW 豬胎兒血管密度較是血管生成相關(guān)基因的 m6A 修飾增加，降低了其表達造成的。研究中，妊娠 109d 時，背膘厚≥21mm 組增加了出生重≤0.9g 和≤例。這與已有的報道數(shù)據(jù)一致（Torres-Rovira et al 2013）。Torres-Rovira

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Sung Woo Kim;Alexandra C Weaver;Yan Bin Shen;Yan Zhao;;Improving efficiency of sow productivity: nutrition and health[J];Journal of Animal Science and Biotechnology;2013年03期

本文編號：2829082