豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)引起的一種能夠?qū)е滦∧c絨毛萎縮脫落而使腸道功能受損的急性傳染病,給規(guī)模養(yǎng)豬業(yè)的穩(wěn)步發(fā)展造成了嚴(yán)重的阻滯。2010年以來(lái),變異的PEDV毒株出現(xiàn)并流行,使得現(xiàn)有疫苗的臨床免疫效果并不理想,為了能夠高效的控制PED的發(fā)生,有必要深入探索PEDV的分子致病機(jī)制。伴隨高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展,測(cè)序后的數(shù)據(jù)在PEDV感染仔豬腸道的研究中發(fā)掘出更多的功能基因,不僅對(duì)PEDV的感染機(jī)制研究有重要意義,同時(shí)也為仔豬腸道免疫應(yīng)答等功能基因組學(xué)的研究提供了新的思維與方法。(1)采用10 mL實(shí)驗(yàn)室分離保存的PEDV病毒液經(jīng)口感染6頭無(wú)PEDV感染的3日齡健康仔豬,4頭對(duì)照組仔豬口服10 mL PBS緩沖溶液,發(fā)病后6 h采集兩組仔豬小腸粘膜組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。(2)研究PEDV感染宿主后致病機(jī)制和宿主免疫應(yīng)答相關(guān)信息。通過使用高通量測(cè)序技術(shù)分析宿主感染PEDV后小腸黏膜基因表達(dá)差異,了解PEDV與宿主之間的相互作用。通過建立PEDV感染仔豬的模型,采集兩組仔豬小腸黏膜組織共計(jì)10份,使用BGISEQ-500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行全基因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。結(jié)果顯示,單個(gè)樣品平均輸出6.55 Gb數(shù)據(jù);轉(zhuǎn)錄本重新組裝后獲得了65525000多個(gè)clean reads和74222000多個(gè)raw reads,樣品比較基因組的平均對(duì)比率為93.55%,比對(duì)基因集的平均比對(duì)率為75.76%;共檢出基因總數(shù)為22605,其中已知的基因?yàn)?2248個(gè),檢測(cè)到的新基因?yàn)?71個(gè);共檢測(cè)出20894個(gè)新轉(zhuǎn)錄本,其中17864個(gè)屬于已知蛋白編碼基因的新的可變剪接亞型,371個(gè)屬于新的蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄本,剩下的2659個(gè)屬于長(zhǎng)鏈非編碼RNA。這些基因中有3168個(gè)基因表達(dá)上調(diào),3876個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。研究轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中差異表達(dá)基因的GO功能顯著性富集分析。通過從分子功能、細(xì)胞組分和生物過程三大功能類別對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,顯著富集的GO條目大多與細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶活化以及生物代謝相關(guān)。通過對(duì)差異表達(dá)基因的KEGG通路分析,差異表達(dá)基因在代謝通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、癌癥信號(hào)通路和粘附斑等這4個(gè)通路中顯著富集。我們發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因主要參與了機(jī)體的代謝過程、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和粘附等,進(jìn)一步推測(cè)這些差異表達(dá)的基因可能參與PEDV感染豬小腸黏膜后調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答和細(xì)胞凋亡。研究驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性。本實(shí)驗(yàn)選取GAPDH為內(nèi)參基因,以PEDV感染后的仔豬腸道黏膜組織和健康仔豬腸道黏膜組織為樣本,從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中挑選28個(gè)生物意義相關(guān)的差異表達(dá)的基因,設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致。(3)研究PEDV感染仔豬后各組織臟器中的帶毒情況。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)組仔豬的心臟、肺臟、脾臟、唾液腺等組織進(jìn)行PEDV的RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示,從實(shí)驗(yàn)組仔豬的腸道、腸系膜淋巴結(jié)和心臟均能檢出,其余臟器均為陰性。且腸道和腸系膜淋巴結(jié)檢出率為100%,心臟為16.7%�？沙醪酵茰y(cè)PEDV感染機(jī)體后可在腸道組織以外的器官分布。(4)研究PEDV感染仔豬后各臟器組織TLR4和TLR6受體基因表達(dá)情況。通過熒光定量PCR方法對(duì)兩組仔豬群的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)組織進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,TLR4和TLR6含量表達(dá)總體處于下降趨勢(shì),而在脾臟和腎臟含量較高,且差異顯著。預(yù)測(cè)PEDV感染仔豬后臟器TLR4和TLR6可能參與抗病毒免疫應(yīng)答。綜上所述,本研究對(duì)感染PEDV后仔豬小腸黏膜組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,獲得了差異基因并就病毒感染相關(guān)的基因進(jìn)行注釋分析主要分布在代謝通路和PI3K-Akt信號(hào)通路,且對(duì)PEDV感染分布和Toll-like受體免疫應(yīng)答情況進(jìn)行研究。為初步探索PEDV致病機(jī)制和免疫應(yīng)答提供數(shù)據(jù)支持,并且為進(jìn)一步研究PED臨床診斷和防控措施提供參考依據(jù)。
【學(xué)位單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S858.28
【部分圖文】：

圖 1-1 轉(zhuǎn)錄組重測(cè)序信息分析流程圖Figure 1-1 Transcriptome Resequencing analysis pipeline. 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析通過控制多重配對(duì)比較的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）校正所有 GO 和 KEGG著性水平，并將具有顯著富集值的術(shù)語(yǔ)確定為目標(biāo)。Pvalue ≤ 0.05，|log2Ratio| ≥1 的基因被認(rèn)為是表達(dá)差異顯著的基因。 差異表達(dá)基因的 qRT-PCR 驗(yàn)證.1 引物設(shè)計(jì)為了驗(yàn)證 RNA-seq 結(jié)果的準(zhǔn)確性，隨機(jī)挑選 28 個(gè)生物意義相關(guān)的基因PCR 分析。使用 Primer premier 5.0 對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表 1-2已公開的參考基因選擇內(nèi)參照基因（GAPDH）[111]。所有反應(yīng)設(shè)三個(gè)重GAPDH（Genbank: 396823）作為內(nèi)生參考，相對(duì)基于此計(jì)算每個(gè) D水平比較閾值。表 1-2 qRT-PCR 分析引物

2 結(jié)果染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果毒 4 日齡仔豬后，15-20 h 左右出現(xiàn)嘔吐癥狀，嘔吐。20-25 h 左右仔豬出現(xiàn)腹瀉癥狀，腹瀉物為腥臭味 成功感染仔豬。測(cè)序結(jié)果分析量檢測(cè)結(jié)果Izol 試劑的方法提取的 RNA，進(jìn)行凝膠電泳，確定抽 的污染情況，如圖 2-1 所示。結(jié)果顯示 28S、18S、NA 完整性好（如圖 2-2）。使用 Agilent 2100 生化分ano Kit）檢查 RNA 完整性 RIN 值均大于 7.0，檢測(cè) 2 2-2），表明上述提取總 RNA 完整性好，能達(dá)到 B具體數(shù)據(jù)結(jié)果如表 2-1。以上結(jié)果顯示 RNA 樣品沒可以送測(cè)序公司（華大基因）構(gòu)建文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

TPD1和CPD1Agilent2100檢測(cè)

【參考文獻(xiàn)】

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1 李凱年;;證據(jù)表明在離被感染豬群較遠(yuǎn)空氣中的PEDV也具有感染性[J];中國(guó)動(dòng)物保健;2014年10期

2 郝飛;湯德元;羅險(xiǎn)峰;曾智勇;李春燕;甘振磊;王鳳;劉建;;規(guī)�；i場(chǎng)主要病毒性繁殖障礙性疾病的臨床表現(xiàn)及病理變化[J];豬業(yè)科學(xué);2012年04期

3 張志榜;陳建飛;時(shí)洪艷;楊斌;石達(dá);陳小金;馮力;;豬流行性腹瀉病毒M蛋白單克隆抗體的制備及鑒定[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2011年07期

4 張百靈;陳建飛;邢雅玲;馮力;陳忠斌;;豬流行性腹瀉病毒(PEDV)與抗病毒天然免疫[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2011年06期

5 張志榜;陳建飛;時(shí)洪艷;陳小金;馮力;;豬流行性腹瀉病毒CH/S株M蛋白全長(zhǎng)的原核表達(dá)及其反應(yīng)原性分析[J];中國(guó)獸醫(yī)科學(xué);2011年01期

6 滕曉坤;肖華勝;;基因芯片與高通量DNA測(cè)序技術(shù)前景分析[J];中國(guó)科學(xué)(C輯:生命科學(xué));2008年10期

7 孫東波;馮力;時(shí)洪艷;陳建飛;;豬流行性腹瀉病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2006年10期

8 王海坤;韓代書;;Toll樣受體(TLRs)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與免疫調(diào)節(jié)[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2006年09期

9 劉惠莉 ,陸承平;冠狀病毒基因組及其編碼蛋白[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2004年02期

10 王繼科;劉長(zhǎng)明;馬思奇;王明;魏鳳祥;于文濤;周金法;;豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉病毒的免疫電鏡診斷的研究[J];中國(guó)畜禽傳染病;1991年02期

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1 邢凱;侯卓成;王曉鑠;季濤;王楚端;;背膘極端表現(xiàn)豬脂肪和肝臟組織的表達(dá)譜分析[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2013年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2013年

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1 王金蘭;脊椎動(dòng)物Toll樣受體識(shí)別多樣病原體機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2016年

2 石達(dá);宿主蛋白NPM1、EB3和HSP47對(duì)PEDV復(fù)制影響[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

3 曹麗艷;豬流行性腹瀉病毒感染豬小腸上皮細(xì)胞抑制IFN-β產(chǎn)生及激活NF-κB機(jī)理研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 陳偉;萊蕪豬和大白豬背最長(zhǎng)肌miRNA與mRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及特征分析[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

5 侯俊玲;豬帶絳蟲基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及Wnt基因家族的分析研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年

6 李新建;豬脂肪沉積關(guān)鍵基因篩選及TCTP基因功能研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2011年

本文編號(hào)：2821478