天然免疫系統(tǒng)的作用機(jī)制是依靠模式識(shí)別受體(PRRs)對(duì)病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)進(jìn)行識(shí)別,從而在病原體識(shí)別和保護(hù)性免疫應(yīng)答啟動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,有助于宿主防御微生物感染。核酸分子包括RNA和DNA是非常重要的PAMPs,對(duì)病毒而言更是如此。RNA病毒對(duì)人類和動(dòng)物健康構(gòu)成嚴(yán)峻的挑戰(zhàn),因此了解RNA受體的免疫生物學(xué)對(duì)于控制病毒感染至關(guān)重要。RNA受體由TLR3,TLR7,TLR8,RIG-I,MDA5,NLRP3,NOD2和其他少數(shù)PRRs組成。本研究主要聚焦雙鏈RNA(dsRNA)識(shí)別受體豬TLR3(pTLR3),克隆表達(dá)pTLR3,鑒定其信號(hào)功能;構(gòu)建pTLR3-NF-κB信號(hào)報(bào)告細(xì)胞系,并用于非洲豬瘟病毒(ASFV)調(diào)控蛋白的篩選;重點(diǎn)研究pTLR3和另外dsRNA主要識(shí)別受體pRIG-I、pMDA5之間的信號(hào)功能關(guān)系;最后制備pTLR3單克隆抗體用于下游研究。主要研究?jī)?nèi)容如下:1.豬TLR3基因的克隆、表達(dá)和信號(hào)功能鑒定從豬的肺泡巨噬細(xì)胞中提取總RNA并使用RT-PCR對(duì)豬TLR3基因(pTLR3)進(jìn)行擴(kuò)增,,對(duì)得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后使用SalI和Sma I進(jìn)行雙酶切處理,將酶切產(chǎn)物連接到使用Sal I和及EcoR V進(jìn)行雙酶切的pENTR4-MCS-2HA載體上,構(gòu)建了中間質(zhì)粒pENTR4-pTLR3-2HA,序列分析發(fā)現(xiàn)豬TLR3開放讀碼框全長(zhǎng)為2737 bp。利用LR位點(diǎn)特異性重組將pTLR3轉(zhuǎn)移到pDEST47載體中,構(gòu)建含有豬TLR3的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA pTLR3。將pcDNA pTLR3質(zhì)粒對(duì)HEK293T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染并使用Western blotting驗(yàn)證pTLR3是否正確表達(dá)。ISRE啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)中,豬TLR3能夠顯著地介導(dǎo)配體dsRNA類似物HMW polyI:C刺激引起的下游轉(zhuǎn)錄因子IRF3活化,表明pTLR3具有信號(hào)功能。2.豬TLR3-NF-KB信號(hào)穩(wěn)定報(bào)告細(xì)胞系的構(gòu)建及非洲豬瘟病毒(ASFV)多基因家族(MGF)蛋白的調(diào)控作用篩選用實(shí)驗(yàn)室已有的293-NF-κB雙熒光素酶信號(hào)報(bào)告細(xì)胞系轉(zhuǎn)染pcDNA pTLR3,構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達(dá)pTLR3的pTLR3-293-NF-κB信號(hào)報(bào)告細(xì)胞系。該穩(wěn)定細(xì)胞系能夠?qū)sRNA類似物HMW polyI:C刺激產(chǎn)生高效、特異和穩(wěn)定的應(yīng)答,因此將這個(gè)細(xì)胞系用于TLR3-NF-KB信號(hào)通路調(diào)控因子的篩選。上述pTLR3-NF-κB和實(shí)驗(yàn)室已有的人TLR3/RIG-I-ISRE信號(hào)報(bào)告細(xì)胞系同時(shí)用來篩選非洲豬瘟病毒(ASFV)基因產(chǎn)物的信號(hào)調(diào)控作用。ASFV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染報(bào)告細(xì)胞、不同刺激劑刺激轉(zhuǎn)染報(bào)告細(xì)胞,應(yīng)用雙熒光素酶(Luciferase)檢測(cè)試劑檢測(cè)下游信號(hào)并篩選非洲豬瘟病毒基因的調(diào)控作用。結(jié)果表明,ASFV多基因家族(MGF)調(diào)控蛋白12L,13L,UK,A276R,A528R能夠抑制 pTLR3-NF-KB 和 TLR3-ISRE 細(xì)胞信號(hào)通路;12L 和 UK 對(duì) RIG-I/MDA5-ISRE 信號(hào)有抑制作用;這些ASFV蛋白對(duì)IFN-ISRE信號(hào)沒有顯著影響。ASFV結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白P30,P54 能顯著地抑制 pTLR3-NF-κB 活性,但是對(duì) pTLR3-ISRE、RIG-I/MDA5-ISRE 和IFN-ISRE信號(hào)沒有顯著影響。重要的是,我們發(fā)現(xiàn)P30,P54的細(xì)胞毒性非常明顯。P54是ASFV內(nèi)膜蛋白,細(xì)胞凋亡功能已經(jīng)報(bào)道,P30的細(xì)胞毒性作用還沒有報(bào)道,值得進(jìn)一步研究。3.豬TLR3與MDA5、RIG-I的免疫信號(hào)功能相互關(guān)系研究利用CRISPR-CAS9技術(shù)設(shè)計(jì)pTLR3的gRNA,構(gòu)建gRNA表達(dá)慢病毒,慢病毒感染PAM和PK15。使用嘌呤霉素對(duì)pTLR3基因敲除穩(wěn)定細(xì)胞進(jìn)行了篩選,并同樣獲得了pTLR3 KO PAM 和 pTLR3 KO PK15 細(xì)胞,上述細(xì)胞分別用 HMW/LMW polyI:C、EMCV、VSV、SeV刺激并檢測(cè)下游基因表達(dá)。定量RT-PCR結(jié)果表明TLR3敲除能增強(qiáng)LMWpolyI:C、EMCV、VSV、SeV刺激RIG-I/MDA5下游基因的表達(dá),提示pTLR3信號(hào)能抑制pRIG-I/MDA5信號(hào)。同時(shí)利用我們實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建的pRIG-I KO和MDA5 KOPAM/PK15細(xì)胞,HMW polyI:C刺激TLR3下游基因表達(dá)都減弱,提示RIG-I和MDA5都能增強(qiáng)TLR3的信號(hào)。另一方面,將不同濃度的pTLR3分別和pRIG-I、pMDA5共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,定量RT-PCR和ELAM啟動(dòng)子報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果表明pTLR3能抑制RIG-I和MDA5下游的基因表達(dá)和NF-κB活性。反之,將不同濃度的pRIG-I、pMDA5分別和pTLR3共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,結(jié)果表明pRIG-I和pMDA5都能增強(qiáng)pTLR3下游的基因表達(dá)和ISRE啟動(dòng)子活性。MAVS是RIG-I和MDA5下游的信號(hào)接頭蛋白,不同濃度的pMAVS和pTLR3共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,也能增強(qiáng)pTLR3下游的ISRE啟動(dòng)子活性。這些結(jié)果與PAM和PK15基因敲除細(xì)胞上實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步分析pTLR3、pRIG-I、pMDA5分子結(jié)構(gòu)域?qū)ζ渌肿有盘?hào)的影響。分別構(gòu)建 pTLR3 胞外區(qū)(pTLR3 ECD)、缺失胞外區(qū)(pTLR3 △ECD),pRIG-I/MDA52CARDs 缺失區(qū)(pRIG-I△2CARDs、pMDA5△2CARDs)的 pcDNA 真核表達(dá)質(zhì)粒。將不同濃度的 pTLR3 ECD、pTLR3 △ECD 分別和 pRIG-I/MDA5 共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞,RT-qPCR和ELAM啟動(dòng)子實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pTLR3 ECD能夠抑制pRIG-I和pMDA5下游的基因表達(dá)和NF-κB啟動(dòng)子活性。反之,將不同濃度的pRIG-I2CARDs、pRIG-I△2CARDs、pMDA52CARDs、pMDA5 △2CARDs 分別和 pTLR3 共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞,RT-qPCR 和 ISRE 啟動(dòng)子試驗(yàn)結(jié)果表明pRIG-I 2CARDs和pMDA5 2CARD都能增強(qiáng)pTLR3下游基因表達(dá)和ISRE啟動(dòng)子活性。以上結(jié)果表明pTLR3全長(zhǎng)及其ECD能夠抑制pRIG-I/pMDA5下游基因表達(dá)和NF-κB活性,但pTLR3 △ECD對(duì)pRIG-I/pMDA5信號(hào)的影響不規(guī)律。pRIG-I和pMDA5全長(zhǎng)及其2CARDs能增強(qiáng)pTLR3下游基因表達(dá)和ISRE活性,而pRIG-I △2CARDs和pMDA5△2CARDs對(duì)TLR3活性的影響沒有規(guī)律。4.豬TLR3單克隆抗體的制備將pENTR4-pTLR3中間質(zhì)粒LR位點(diǎn)特異重組到pDest527-cDNA載體中,構(gòu)建含有pTLR3的原核表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá),并確定包涵體表達(dá)量最高時(shí)的IPTG誘導(dǎo)濃度為1mM、溫度為37℃、時(shí)間2h。在此條件下進(jìn)行大量搖菌并進(jìn)行蛋白純化,純化蛋白免疫BALB/c小鼠,獲取脾細(xì)胞并與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合,使用有限稀釋法對(duì)ELISA 陽性雜交瘤細(xì)胞做三次稀釋處理,最終獲得可以穩(wěn)定分泌pTLR3特異性抗體的細(xì)胞株,效價(jià)可達(dá)1:102400。該抗體在Western-blotting中可以特異識(shí)別內(nèi)源性蛋白。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.4
【部分圖文】：

２ｋｂＢ＾Ｈ逡逑圖１－１豬ＴＬＲ３基因的ＰＣＲ擴(kuò)增邐圖１－２重組質(zhì)粒ｐＥＮＴＲ４－ｐＴＬＲ３酶切鑒定逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｏｒｃｉｎｅ邋ＴＬＲ３邋ｇｅｎｅ邐Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｅｎｚｙｍｅ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｐＥＮＴＲ４－ｐＴＬＲ３逡逑Ｍ：邋ＤＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ邐Ｍ：邋ＤＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ逡逑１，２，邋３，邋４：邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｏｆ邋ｐｏｒｃｉｎｅ邋ＴＬＲ３邐１，２：邋Ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｐｏｒｃｉｎｅ邋ＴＬＲ３邋ｄｉｇｅｓｔｅｄ邋ｂｙ邋Ｓａｌ邋Ｉ邋ａｎｄ邋Ｓｍａ邋Ｉ逡逑２．２重組質(zhì)粒ｐＥＮＴＲ４－ｐＴＬＲ３－２ＨＡ的構(gòu)建逡逑ｐＴＬＲ３邋ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行制Ｉ邋ａｎｄ邋Ｉ雙酶切，同時(shí)中間載體ｐＥＮＴＲ４－２ＨＡ逡逑用５Ｗ邋Ｉ邋ａｎｄ及Ｖ雙酶切。酶切產(chǎn)物膠回收的ｐＴＬＲ３與穿梭載體ｐＥＮＴＲ４－２ＨＡ連接，逡逑構(gòu)建重組中間質(zhì)粒ｐＥＮＴＲ４－ｐＴＬＲ３－２ＨＡ。挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒逡逑定（５＞？0１和５ＷＩ邋），酶切ｐＥＮＴＲ４－ｐＴＬＲ３的條帶大�。担保耄�，符合預(yù)期（如圖１－２）；逡逑測(cè)序結(jié)果也表明中間質(zhì)粒構(gòu)建成功。逡逑２．３邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔｔｉｎｇ邋鑒定邋ｐＴＬＲ３邋的表達(dá)逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔｔｉｎｇ結(jié)果表明，抗ＨＡ抗體能夠識(shí)別＆１２０ＫＤ位置的特異性的條帶，而空

Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐＴＬＲ３邋ｉｎ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋２９３Ｔ邋ｃｅｌｌｓ逡逑質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)逡逑站中Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋Ｄｏｍａｉｎｓ的ＣＤ－ｓｅａｒｃｈ在線應(yīng)用預(yù)測(cè)豬ＴＬＲ３具有典型的ＴＬＲ結(jié)構(gòu)域特征，分別由Ｎ端的含有２２ＬＲＲＣＴ、跨膜區(qū)以及胞質(zhì)ＴＩＲ結(jié)構(gòu)域組成（圖１－４）。逡逑５００邐１０００邐１５００邐２０００邐２５００Ｉ邋Ｉ邋！邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋ｆｆＨｔｉＭａｉａａａｉａＢＨｉａＢＢＢａｉＢＭｉＢｉｉｉａａｉｉｉｉｉｉａＢｉＢａａａｉＨＭＨｌ？ｗｃｉｎ？－ｒｉｃｈ邋ｒｅｐｅａｔ邋＜：邐一）邋ｌｗｃｉｎｅ寸ｉｃｈ邐ｋ？ｃｉｎ？－ｒｉｃｈ邋ｒｅｐｅａｔ逡逑ａｔ邋0邐ｌｃｕｃｉｈ？－ｒｉｃｈ邐ｋｕｃｉｎｃ－ｒｉｃｈ邋ｒ４ｐＭｉ0邋ｌｅｕｃｉｎ？＿ｒｉｃｈ邋ｒ＾ｐＭｔＯ逡逑ｒ？ｐ？ｆｌｉ0邋ｌ？？ｃｉｎ？－ｐｉｃｈ邐ｌ？ｗｃｉｎ＊寸ｉｃｈ邋ｒｔｔｐＭｔ邋0逡逑ｃｈ邋ｒ？ｐｃ＜ｉｉＣＪ邋ｌ？？ｃｉｈｅ－ｒｉｃｈ邋ｒｅｐｅａｔ＾１）邋ｌｅｕｃｉｔｔｔ－ｒｉｃｈ邋ｒｅｐｅａｔ逡逑ｅ－ｒｉｃｈ邐ｌ？ｕｃｉｎ？－ｒｉｃｈ邋ｒｅｐｅａｔ邋0邋ｌｅｕｃｉｎ？－ｒｉｃｈ逡逑ｃｉｈ４－ｒｉｃｈ邐？＞邐Ｕｗｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ逡逑ｌｗｃｉｎｔ－ｒｉｃｈ邋ｒｅｐｅａｔ邐ｌ？？ｃｉｎｔ－ｒｉｃｈ邋ｒ？ｐｅａｉ＜＾逡逑ｋｕｃｉｒｉｆｔ－ｒｉｃｈ邋ｒｅｐｗｔ＾逡逑x5：ｍ彳邐ｔｉｒｊ邋：＾ＩＰＫＲ．Ｃ２ｉ逡逑

逡逑ＴＬＲ３邋Ｖｅｃｔｏｒ逡逑ＰＴＬＲ３邐§邐１２０ｋＤａ逡逑ｐ－ａｃｔｉｎ邐４２ｋＤａ逡逑圖１－３邋ｐＴＬＲ３在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐＴＬＲ３邋ｉｎ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋２９３Ｔ邋ｃｅｌｌｓ逡逑２．４豬ＴＬＲ３蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)逡逑利用ＮＣＢＩ網(wǎng)站中Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋Ｄｏｍａｉｎｓ的ＣＤ－ｓｅａｒｃｈ在線應(yīng)用預(yù)測(cè)豬ＴＬＲ３蛋白質(zhì)結(jié)逡逑構(gòu)域，表明該ｐＴＬＲ３具有典型的ＴＬＲ結(jié)構(gòu)域特征，分別由Ｎ端的含有２２個(gè)ＬＲＲ重復(fù)序逡逑列的胞外域、１個(gè)ＬＲＲＣＴ、跨膜區(qū)以及胞質(zhì)ＴＩＲ結(jié)構(gòu)域組成（圖１－４）。逡逑

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本文編號(hào)：2821163