發(fā)布時間：2020-09-11 12:06

　　 血管生成素樣蛋白5(ANGPTL5)為ANGPTLs家族成員,主要表達于心臟、脂肪組織。目前,研究顯示ANGPTL5參與體內(nèi)血管生成,同時其在調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成與代謝方面也發(fā)揮著重要作用。本課題組前期研究結(jié)果顯示,在日本和牛內(nèi)臟脂肪和皮下脂肪中ANGPTL5表達水平存在顯著差異,表明ANGPTL5基因很可能參與并影響牛機體內(nèi)脂肪沉積。因此,本試驗以ANGPTL5作為影響牛脂肪代謝的候選基因,在中國西門塔爾牛和中國荷斯坦奶牛群體中對ANGPTL5基因的遺傳多態(tài)性進行檢測,并統(tǒng)計分析ANGPTL5基因的SNPs位點與乳品質(zhì)性狀和肉品質(zhì)性狀的相關(guān)性。為進一步研究ANGPTL5基因?qū)εＶ敬x的影響,通過實時熒光定量PCR擴增,檢測了牛脂肪組織、肌肉組織和各器官以及前體脂肪細胞中的表達水平。在細胞水平上,將構(gòu)建的p BI-CMV3-ANGPTL5基因過表達載體和sh RNA干擾載體分別轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮和前體脂肪細胞,檢測ANGPTL5基因?qū)毎麅?nèi)甘油三酯含量的影響。實驗結(jié)果顯示,在中國荷斯坦奶牛群體中共篩查到三個SNPs位點,分別為I1-1776GA位點、I5-2743AC位點和I5-2757TC位點。其中,I5-2743AC和I5-2757TC位點與中國荷斯坦牛產(chǎn)奶和乳品質(zhì)性狀沒有相關(guān)關(guān)系;I1-1776GA位點與中國荷斯坦牛尿素氮含量顯著相關(guān)(p0.05)。在中國西門塔爾肉牛群體中,檢測到了四個SNPs位點,分別為I1-1776GA、I2-77TC、I2-1505AT和I2-1391CT位點。其中,I1-1776GA位點與中國西門塔爾牛前蹄重、后蹄重、肝臟重、脾臟重、背膘厚呈顯著相關(guān)關(guān)系(p0.05);I2-1391CT位點與中國西門塔爾牛前蹄重、后蹄重、肝臟重、脾臟重、背膘厚呈顯著相關(guān)關(guān)系(p0.05);I2-1391CT和I2-1505AT位點與中國西門塔爾牛背膘厚呈顯著相關(guān)關(guān)系(p0.05)。ANGPTL5基因在心臟中的表達水平最高,肝臟中的表達水平最低。前體脂肪細胞中ANGPTL5表達水平,顯著低于乳腺上皮細胞的表達水平,皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪中的基因表達水平顯著高于前體脂肪細胞。在過表達牛ANGPTL5基因的牛前體脂肪細胞和乳腺上皮細胞中甘油三酯的含量顯著升高(p0.05),而在ANGPTL5基因沉默的牛前體脂肪細胞中甘油三酯的含量顯著下降(p0.05),ANGPTL5基因沉默的牛乳腺上皮細胞中甘油三酯的含量顯著升高(p0.05)。綜上所述,本試驗結(jié)果表明ANGPTL5基因內(nèi)含子區(qū)域的SNPs位點與牛肉質(zhì)、胴體和乳品質(zhì)性狀均存在顯著相關(guān)性;ANGPTL5基因表達促進細胞內(nèi)甘油三酯合成。以上研究結(jié)果為解析ANGPTL5對脂肪代謝的功能提供研究基礎(chǔ),也為牛乳品質(zhì)和肉品質(zhì)改良以及分子育種提供功能基因和遺傳標記。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S823
【部分圖文】：

圖 1.1 血液基因組 DNA 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果注：1~6.中國荷斯坦奶牛血液基因組 DNAThe agarose electrophoresis result of bovine blood genNote：1~6. The genomic DNA of Chinese Holstein cow blood增結(jié)果取基因組 DNA 為模板，用設(shè)計的 6 對引物進行擴增2、3、4、6 泳道 PCR 產(chǎn)物長度與預期相符，條帶均 泳道 PCR 產(chǎn)物有兩條帶，引物特異性不好，產(chǎn)生非續(xù)膠回收測序，結(jié)果見圖 1.2。

PTL5 基因中國荷斯坦奶�；斐啬０� PCR 產(chǎn)物瓊脂糖注：M.DL2000Marker, 1～6.PCR 產(chǎn)物。he result of PCR amplification of ANGPTL5 gene in Chindairy cowsNote: M. DL2000 marker, 1～6. Production of PCR.斯坦奶牛群體中 ANGPLT5 基因 SNPs 位點篩查 PCR 擴增后送金唯智測序，通過分析混池測序結(jié)果R 產(chǎn)物中存在一處明顯的雙峰，是 I1-1776 處的 G>A 荷斯坦奶牛群體中，ANGPTL5 基因在這兩個位點具果見圖 1.3，引物 6 擴增的 PCR 產(chǎn)物中存在兩處明顯 處的 A>C 顛換和 I5-2757 處的 T>C 轉(zhuǎn)換，由此可得，和 SNPs 位點篩查測序，在中國荷斯坦奶牛群體中針對個 SNPs 位點。

圖 1.3 中國荷斯坦牛 ANGPTL5 基因混池 PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果注：A. I1-1776 G>A 位點測序圖，B. I5-2743A>C 位點測序圖，C .I5-2757 T>C 位點測序圖。Fig 1.3 The sequencing results of ANGPTL5 gene for Chinese Holstein dairy cowssamplesNote: A. I1-1776 G>A sequencing result, B.I5-2743 A>C locus sequencing result, C.I5-2757 T>Clocus sequencing result.基于在混池測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，在引物 E6 擴增的 PCR 產(chǎn)物中存在兩個 SNPs位點，而且片段大小適中，能夠通過一個測序反應同時對兩個位點進行檢測，因此選用直接測序的方法來檢測該中國荷斯坦奶牛群體的 SNP。進行該群體單個樣品 PCR 擴增后，將部分產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳實驗，選取電泳條帶清晰均一，無二聚體和抹帶的PCR產(chǎn)物送測序，共對103個樣本進行測序。最終，I5-2743A>C位點獲得 96 個有效結(jié)果，I5-2757T>C 位點也獲得了 96 個有效結(jié)果。對引物 2擴增的PCR產(chǎn)物也采取直接測序的方法，共對116個樣本進行測序，最終，I1-1776G>A 位點獲得 113 個有效結(jié)果。各 SNPs 不同基因型部分測序結(jié)果如圖 1.4 所示。

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