破骨細(xì)胞(osteoclast,OC)是一種終末分化的多核巨細(xì)胞,來源于造血干細(xì)胞,在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)及核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)等多種細(xì)胞因子及激素的誘導(dǎo)下分化形成破骨細(xì)胞前體(osteoclast precursor,OCP),進一步融合后形成破骨細(xì)胞。黏附在骨基質(zhì)表面的破骨細(xì)胞被激活后發(fā)揮骨吸收功能。骨骼中破骨細(xì)胞數(shù)量及活性的異常與多種骨代謝性疾病的發(fā)生有關(guān),如骨質(zhì)疏松癥、骨硬化癥及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。破骨細(xì)胞前體表達(dá)多種受體蛋白,主要包括巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體(macrophage colony-stimulating factor receptor,c-fms)、核因子κB受體活化因子(receptor activatorfornuclearfactor-κB,RANK)、富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體4(leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 4,LGR4)等,多種受體的相互作用共同調(diào)控破骨細(xì)胞前體向破骨細(xì)胞的分化過程。維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)是一種類固醇激素受體,主要分布在細(xì)胞核,細(xì)胞膜上也有少量分布。VDR參與多個系統(tǒng)及細(xì)胞的功能調(diào)控作用,包括代謝、免疫及發(fā)育等。小腸和腎臟中的VDR主要通過調(diào)控鈣磷的重吸收來間接影響骨代謝過程,而骨組織中VDR的表達(dá)可以直接調(diào)控骨重建過程,參與調(diào)控破骨細(xì)胞的分化及骨吸收。成骨細(xì)胞(osteoblast,OB)及骨細(xì)胞(osteocyte)中VDR的表達(dá)主要通過促進RANKL的表達(dá),同時抑制骨保護素(osteoprotegerin,OPG)的分泌來調(diào)控破骨細(xì)胞的功能,而破骨細(xì)胞前體中VDR的表達(dá)對破骨細(xì)胞分化及骨吸收的影響尚不明確。本文旨在研究破骨細(xì)胞前體中VDR對破骨細(xì)胞分化及骨吸收功能的調(diào)控作用及機制,為揭示VDR調(diào)控骨代謝的分子機制提供科學(xué)依據(jù)。1.小鼠破骨細(xì)胞體外分化模型的建立體內(nèi)破骨細(xì)胞存活時間短,數(shù)量少且分離困難。為獲取大量具有骨吸收功能的破骨細(xì)胞,本文通過分離培養(yǎng)破骨細(xì)胞前體—骨髓巨噬細(xì)胞(bone marrow macrophage,BMM)誘導(dǎo)分化形成破骨細(xì)胞,同時利用成骨細(xì)胞建立破骨細(xì)胞的共培養(yǎng)體系。在破骨細(xì)胞直接誘導(dǎo)體系中,骨髓巨噬細(xì)胞按照1×104、2×104和5×104個/孔的細(xì)胞密度接種到96孔板中,同時添加30 ng/ml M-CSF及50 ng/ml RANKL進行誘導(dǎo)分化。結(jié)果表明,不同細(xì)胞接種密度下誘導(dǎo)4-5 d后均可形成破骨細(xì)胞,但破骨細(xì)胞的分化效率隨著骨髓巨噬細(xì)胞接種密度的升高而降低(P0.01)。在1×104個/孔的接種密度下,破骨細(xì)胞產(chǎn)生的數(shù)量最多,且骨吸收活性強。表明破骨細(xì)胞前體的細(xì)胞數(shù)量與破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化效率存在一定關(guān)系。在破骨細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中,成骨細(xì)胞按照1 ×103個/孔的細(xì)胞密度接種到96孔板中,培養(yǎng)過夜后,將骨髓巨噬細(xì)胞按照上述細(xì)胞密度接種到預(yù)置有成骨細(xì)胞的96孔板中,同時加入前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)誘導(dǎo)分化。結(jié)果表明,成骨細(xì)胞與骨髓巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)6-7 d后,能誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成,同時PGE2能夠提高破骨細(xì)胞的分化效率。表明破骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系的成功建立。2.維生素D受體在小鼠破骨細(xì)胞分化過程中的表達(dá)分布利用骨髓巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成破骨細(xì)胞。通過RTCA檢測破骨細(xì)胞分化過程中細(xì)胞增殖及活性的變化,免疫熒光染色觀察VDR在破骨細(xì)胞前體及破骨細(xì)胞中的表達(dá)分布,RT-PCR檢測破骨細(xì)胞分化過程中相關(guān)標(biāo)志基因及VDR轉(zhuǎn)錄水平的變化,Western blot檢測破骨細(xì)胞分化過程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NFATcl及VDR蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明,破骨細(xì)胞前體及破骨細(xì)胞中均有VDR的表達(dá),且VDR主要分布在細(xì)胞核中,少量分布在細(xì)胞膜上。VDR在破骨細(xì)胞分化過程中隨著破骨細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NFATcl及相關(guān)標(biāo)志基因TRAP、CAII及MMP-9表達(dá)的升高而降低(P0.01)。表明破骨細(xì)胞前體中VDR的表達(dá)可能參與破骨細(xì)胞分化及骨吸收功能的調(diào)控。3.破骨細(xì)胞前體中VDR的激活對小鼠破骨細(xì)胞分化的影響添加VDR激活劑1α,25-(OH)2D3及VDR過表達(dá)病毒激活或過表達(dá)破骨細(xì)胞前體中VDR,同時利用M-CSF及RANKL誘導(dǎo)形成破骨細(xì)胞。利用RTCA檢測VDR激活劑對破骨細(xì)胞前體細(xì)胞增殖及分化中細(xì)胞活性的影響,TRAP染色觀察破骨細(xì)胞的形成數(shù)量,RT-PCR檢測破骨細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志基因mRNA的表達(dá),Western blot檢測破骨細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)。另外通過建立體外破骨細(xì)胞共培養(yǎng)模型,進一步明確破骨細(xì)胞前體中VDR對破骨細(xì)胞形成的影響。結(jié)果表明,VDR激活劑對破骨細(xì)胞前體的增殖無顯著影響(P0.05),破骨細(xì)胞前體中VDR激活或過表達(dá)后抑制破骨細(xì)胞的分化,且呈現(xiàn)一定的濃度-時間效應(yīng)關(guān)系(P0.05)。同時破骨細(xì)胞前體中VDR激活或過表達(dá)后抑制破骨細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因TRAP、DC-STAMP及Integrinβ3的轉(zhuǎn)錄及翻譯水平(P0.01)。在破骨細(xì)胞共培養(yǎng)模型中,破骨細(xì)胞前體中VDR過表達(dá)后,破骨細(xì)胞形成數(shù)量減少(P0.05)。表明破骨細(xì)胞前體中VDR的激活或過表達(dá)抑制破骨細(xì)胞分化。4.破骨細(xì)胞前體中VDR的激活抑制小鼠破骨細(xì)胞分化的機制在M-CSF及RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化過程中,添加VDR激活劑1α,25-(OH)2D3,通過Western blot檢測破骨細(xì)胞分化早期信號及轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響;添加c-fos過表達(dá)病毒構(gòu)建破骨細(xì)胞前體中c-fos基因的過表達(dá)模型,在此基礎(chǔ)上激活VDR,TRAP染色觀察破骨細(xì)胞的形成數(shù)量,RT-PCR檢測破骨細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá);添加基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的抑制劑,RT-PCR及Western blot檢測破骨細(xì)胞前體中VDR激活后對轉(zhuǎn)錄因子c-fos mRNA及蛋白穩(wěn)定性的影響;構(gòu)建VDR及c-fos的標(biāo)簽融合表達(dá)載體,免疫共沉淀及免疫熒光法檢測VDR及c-fos間的相互作用關(guān)系。結(jié)果表明,破骨細(xì)胞前體中VDR的激活對破骨細(xì)胞分化的早期信號MAPKs及Akt信號無顯著影響(P0.05),而抑制關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子c-fos及NFATc1的表達(dá)(P0.01)。破骨細(xì)胞前體中過表達(dá)c-fos后能消除或緩解VDR激活后引起的破骨細(xì)胞分化抑制作用(P0.01)。破骨細(xì)胞前體中VDR的激活降低c-fos的穩(wěn)定性(P0.01),且VDR與c-fos間存在相互作用關(guān)系。表明破骨細(xì)胞前體中VDR的激活能夠與c-fos間產(chǎn)生相互作用,降低c-fos的穩(wěn)定性,進而抑制c-fos及NFATc1的表達(dá),最終抑制破骨細(xì)胞的分化。5.破骨細(xì)胞前體中VDR的激活抑制小鼠破骨細(xì)胞骨吸收功能的機制將破骨細(xì)胞前體培養(yǎng)在牛皮質(zhì)骨片上,利用M-CSF及RANKL誘導(dǎo)形成破骨細(xì)胞,同時添加VDR激活劑1α,25-(OH)2D3。通過掃描電子顯微鏡觀察破骨細(xì)胞骨吸收作用后形成的骨吸收陷窩,RT-PCR檢測破骨細(xì)胞骨吸收相關(guān)基因的表達(dá),熒光顯微鏡觀察破骨細(xì)胞多核化及細(xì)胞骨架的變化,Western blot檢測Rho GTPases中關(guān)鍵調(diào)控蛋白RhoA、Rac1及Cdc42的表達(dá)變化。結(jié)果表明,破骨細(xì)胞前體中VDR的激活抑制了破骨細(xì)胞的骨吸收活性,降低相關(guān)功能蛋白CAII、CK及MMP-9的表達(dá)(P0.01),同時抑制破骨細(xì)胞的多核化及細(xì)胞骨架F-actin環(huán)的形成,降低Rho GTPases中關(guān)鍵調(diào)控蛋白Rac1及Cdc42的表達(dá)(P0.01),表明Rho GTPases中關(guān)鍵調(diào)控蛋白Rac1及Cdc42參與破骨細(xì)胞前體中VDR的激活對破骨細(xì)胞骨吸收活性的抑制作用。
【學(xué)位單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.2

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 江燕;;補充雌激素講究“剛剛好”[J];家庭科技;2017年03期

2 江燕;;補充雌激素講究“剛剛好”[J];益壽寶典;2017年01期

3 劉欣;楊美子;喬珍;綦才輝;金勇君;;黑皮質(zhì)素受體在破骨細(xì)胞形成中的作用[J];中國臨床藥理學(xué)雜志;2012年07期

4 孫超;邱勇;;巨噬細(xì)胞集落刺激因子在破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)中的作用[J];中國骨與關(guān)節(jié)外科;2010年04期

5 張功學(xué);方淑玲;王萬林;丁凱;熊寒涵;齊峰;詹義鳳;姚志平;;伴破骨細(xì)胞樣巨細(xì)胞的乳腺癌一例[J];中外醫(yī)療;2009年36期

6 王珂;李然偉;王秀巖;楊世杰;;表皮生長因子受體對小鼠初級軟骨內(nèi)骨化、破骨細(xì)胞的募集及生成的影響[J];吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2007年03期

7 劉俊棟;顧建紅;劉海霞;王健;劉宗平;;鴨破骨細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定[J];中國獸醫(yī)雜志;2007年11期

8 葉美君,廖世華,王凡;影響破骨細(xì)胞功能的主要因素[J];四川解剖學(xué)雜志;2004年01期

9 劉波,于世鳳;關(guān)于破骨細(xì)胞來源的幾種學(xué)說[J];中國骨質(zhì)疏松雜志;2004年01期

10 遲志永,韓綱,王巖;破骨細(xì)胞的局部調(diào)節(jié)機制[J];中國骨質(zhì)疏松雜志;2004年02期

相關(guān)會議論文 前10條

1 劉程林;李淑娜;季葆華;霍波;;流體刺激對于破骨細(xì)胞遷移影響及機制研究[A];第十一屆全國生物力學(xué)學(xué)術(shù)會議暨第十三屆全國生物流變學(xué)學(xué)術(shù)會議會議論文摘要匯編[C];2015年

2 董世武;竇策;許建中;;破骨細(xì)胞融合的調(diào)控機制研究[A];中國解剖學(xué)會2015年年會論文文摘匯編[C];2015年

3 吳培福;鐘代彬;韓博;黃有德;;氟對動物破骨細(xì)胞的影響[A];2003全國家畜內(nèi)科學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文專輯[C];2003年

4 楊肖;張美;吳家順;湯亞玲;陳宇;;雙熒光標(biāo)記小鼠模型研究破骨細(xì)胞融合過程初探[A];2018口腔病理年會暨第十二次全國口腔病理學(xué)術(shù)會議論文集[C];2018年

5 趙志虎;馬信龍;孫曉雷;馬劍雄;李風(fēng)波;李艷軍;呂建偉;孟新民;;循環(huán)牽張應(yīng)力對破骨細(xì)胞骨吸收活性和凋亡的影響[A];第十一屆全國生物力學(xué)學(xué)術(shù)會議暨第十三屆全國生物流變學(xué)學(xué)術(shù)會議會議論文摘要匯編[C];2015年

6 杜文喜;童培建;;體外破骨細(xì)胞培養(yǎng)的影響因素和分子機制研究進展[A];全國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會骨傷科專業(yè)委員會第十二次學(xué)術(shù)年會浙江省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會骨傷科專業(yè)委員會第十次學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2004年

7 周平;高豐;;17β-雌二醇對破骨細(xì)胞的影響[A];全國動物生理生化第十二次學(xué)術(shù)交流會論文摘要匯編[C];2012年

8 韓大慶;張其清;;破骨細(xì)胞完善類骨組織體外重建的研究[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會2006年學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2006年

9 李建宇;劉璐;萬宗明;郝慶新;郭勇;李瑞欣;張西正;;基底拉伸應(yīng)變對共育體系中成骨與破骨細(xì)胞的影響[A];第十屆全國生物力學(xué)學(xué)術(shù)會議暨第十二屆全國生物流變學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2012年

10 李宏宇;;股骨頭壞死不同區(qū)域微血管密度、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞表達(dá)的研究[A];第二十四屆中國中西醫(yī)結(jié)合骨傷科學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2017年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 錢錚;日本發(fā)現(xiàn)抑制破骨細(xì)胞作用的物質(zhì)[N];中國勞動保障報;2006年

2 錢錚;“W9肽”可抑制破骨細(xì)胞生成[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2006年

3 小新;日發(fā)現(xiàn)雌激素可抑制破骨細(xì)胞作用[N];中國醫(yī)藥報;2007年

4 ;雌激素可抑制破骨細(xì)胞作用[N];農(nóng)村醫(yī)藥報（漢）;2007年

5 范思立;補鈣亟需開創(chuàng)新領(lǐng)域[N];中國經(jīng)濟時報;2007年

6 暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心 姚成燦;TGF-β：重塑傲骨舍我其誰[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2001年

7 記者 顏秋雨 通訊員 王玉林 王建新;中美專家揭示骨生成“三元調(diào)控”機制[N];健康報;2014年

8 編譯 紫箕;2010年獲批的小分子藥物[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2011年

9 鮑捷;抑制破骨細(xì)胞 讓骨質(zhì)疏松剎車[N];健康報;2003年

10 記者 王小龍;科學(xué)家發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞抑制劑[N];科技日報;2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 馬駿;鈣離子通道蛋白TRPV6對小鼠骨代謝和破骨細(xì)胞形成的調(diào)控作用及其機制研究[D];中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué);2019年

2 高延盼;組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L在骨質(zhì)疏松發(fā)病中的作用機制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2018年

3 張洪洋;Hedgehog信號通路對體內(nèi)破骨細(xì)胞及整體骨量調(diào)控作用的研究[D];中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

4 王盼;脈沖電磁場及機械振動對骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞行為功能的調(diào)控效應(yīng)及機制研究[D];中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

5 王洪濤;新芒果苷防治破骨細(xì)胞相關(guān)性骨溶解疾病的機制研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2019年

6 李殿奇;PDGF-BB調(diào)節(jié)成、破骨細(xì)胞的作用機制及促進骨愈合的實驗研究[D];武漢大學(xué);2016年

7 竇策;非編碼RNA參與調(diào)控破骨細(xì)胞前體融合及其多種干預(yù)策略的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2016年

8 馮燕陵;FoxO1介導(dǎo)白藜蘆醇、葛根素抑制破骨細(xì)胞生成和活性的機制研究[D];蘭州大學(xué);2018年

9 王莉芳;時滯與噪聲在生物信號通路中的效應(yīng)研究[D];華中師范大學(xué);2018年

10 王東;破骨細(xì)胞前體中VDR的激活對小鼠破骨細(xì)胞分化和活性的影響[D];揚州大學(xué);2018年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張雪;缺氧環(huán)境下降鈣素對破骨細(xì)胞的影響以及分子機制的研究[D];吉林大學(xué);2019年

2 王堯;紫云英苷減輕小鼠去卵巢后骨質(zhì)丟失及機制研究[D];中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué);2019年

3 王晶;石菖蒲多糖抑制破骨細(xì)胞生成的分子機制研究[D];北華大學(xué);2019年

4 譚艷林;磷酸三鈣材料表面微結(jié)構(gòu)對破骨細(xì)胞整合素信號通路調(diào)控的研究[D];南昌大學(xué);2019年

5 楊興;RANK/TRAF-6/NF-κB1通路在氟砷聯(lián)合染毒成骨與破骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系中對破骨細(xì)胞分化的調(diào)控作用[D];貴州醫(yī)科大學(xué);2019年

6 王瀟;TNF-α對破骨細(xì)胞整合素αv、β3及V-ATP酶的影響[D];廈門大學(xué);2018年

7 高云兵;BX-912對破骨細(xì)胞相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥的影響研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2019年

8 韋靈鋒;破骨細(xì)胞相關(guān)基因生物信息學(xué)分析及NFκB抑制劑JSH-23對破骨細(xì)胞作用研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2019年

9 馮文宇;蛋白激酶C抑制劑G?6983對破骨細(xì)胞的作用機制研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2019年

10 劉開飛;川續(xù)斷皂苷Ⅵ通過抑制破骨細(xì)胞生成來保護膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎引起的骨破壞[D];南方醫(yī)科大學(xué);2019年

本文編號：2816188