乳腺是具有泌乳功能的特殊腺體。在哺乳動物繁殖過程中,泌乳性能影響了后代的成活率和生長速度。哺乳動物的泌乳規(guī)律性變化(如泌乳量的高低、乳成分的變化等)取決于乳腺組織中相關(guān)基因的差異性表達(dá)。調(diào)控綿羊乳腺性能的功能基因及其分子機制仍需要進(jìn)一步探討。本研究選擇年齡、胎次、飼養(yǎng)管理條件相同的3只多羔綿羊品種(小尾寒羊)與3只單羔綿羊品種(甘肅高山細(xì)毛羊)作為研究對象,屠宰后采集泌乳高峰期乳腺組織(產(chǎn)后3周),采用高通量二代測序技術(shù)對2個品種的乳腺組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq),篩選出品種間的差異表達(dá)基因,分析這些基因的GO和KEGG功能富集,鑒定品種間的新mRNA轉(zhuǎn)錄本、SNP和Indels。同時,以篩選出的STAT5a作為候選基因,應(yīng)用qRT-PCR和PCR-SSCP技術(shù),分析STAT5a基因的組織表達(dá)和核苷酸序列變異特征。主要研究結(jié)果如下:1.小尾寒羊和甘肅高山細(xì)毛羊泌乳高峰期乳腺的轉(zhuǎn)錄組特征。在6個乳腺組織RNA測序文庫中分別得到約139 M(million)的原始讀段(Raw Reads),堿基識別準(zhǔn)確率均在99%以上,通過質(zhì)控后,約76.62%的Clean Reads和15041個基因被注釋到綿羊參考基因組上。在2個綿羊品種間,共篩選出226個差異表達(dá)基因,其中上調(diào)基因75個,下調(diào)基因151個。隨機選擇13個差異表達(dá)基因(包括7個上調(diào)基因和6個下調(diào)基因),qRT-PCR發(fā)現(xiàn)這些基因在2個綿羊品種間的差異表達(dá)趨勢與RNA-Seq研究結(jié)果相一致,表明本研究中的RNA-seq具有很高的準(zhǔn)確性。GO和KEGG功能富集分析發(fā)現(xiàn),這些差異表達(dá)基因主要參與鈉離子轉(zhuǎn)運、血管平滑肌收縮、PI3K-Akt信號通路和Notch信號通路等。轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)分析表明,小尾寒羊乳腺組織中存在170436個轉(zhuǎn)錄本,其中155040個為新轉(zhuǎn)錄本,364516個SNPs和42506個Indels。甘肅高山細(xì)毛羊中存在174336個轉(zhuǎn)錄本,其中158847個為新轉(zhuǎn)錄本,397044個SNPs和49012個Indels。2.STAT5a基因表達(dá)特征和核苷酸序列變異特征。STAT5a基因在綿羊7個組織中均有表達(dá),并表現(xiàn)出明顯的品種差異性和組織差異性,在藏綿羊和小尾寒羊中,STAT5a基因在乳腺組織中的表達(dá)量顯著高于其它6個組織(P0.01),而2個品種之間,小尾寒羊乳腺組織的表達(dá)量顯著高于藏綿羊(P0.05),但在肝臟、肺臟、腎臟和小腦的表達(dá)量顯著低于藏綿羊(P0.05);PCR-SSCP分析表明,綿羊STAT5a基因的第10內(nèi)含子、第12外顯子和第15內(nèi)含子上都存在2個等位基因和1個(c.1169+84 AG)、1個(c.1308 AG,為同義突變)和2個SNPs(c.2150-154 CT和c.2150-50 TC)。在第10內(nèi)含子和第12外顯子上,3個綿羊品種的多態(tài)信息含量均處于中度多態(tài),藏綿羊處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài),湖羊和多浪羊偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài);在第15內(nèi)含子上,藏綿羊?qū)儆谥卸榷鄳B(tài),湖羊和多浪羊?qū)儆诘投榷鄳B(tài)。3個綿羊群體均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。本研究篩選出了多羔和單羔綿羊品種間的差異表達(dá)基因,明確了調(diào)控不同產(chǎn)羔數(shù)品種間泌乳性能的生物學(xué)途徑,獲得了泌乳性狀相關(guān)基因STAT5a基因的組織表達(dá)和核苷酸序列變異特征。結(jié)果可作為闡釋綿羊泌乳性狀分子改良的理論基礎(chǔ),也豐富了綿羊基因組學(xué)的研究結(jié)果。
【學(xué)位單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S826
【部分圖文】：

圖 1 信息分析流程Figure 1 information analysis process1.6.1 原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制、過濾及序列比對采用 FastQC（http://en. wikipedia.org/wiki/FASTQ_format）對下機數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控后獲得 Clean reads。應(yīng)用 Bowite 2 建立參考基因組索引，然后使用 Tophat2 將過濾后的 Reads 比對到參考基因組（Ensemble 數(shù)據(jù)庫的 Ovis_aries.Oar_v3.1.dna.toplevel.fa），應(yīng)用 HiSeq 軟件對 reads count 數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析[48, 49]。1.6.2 基因表達(dá)水平及差異分析將唯一比對到參考基因組上的 reads 用于基因表達(dá)量統(tǒng)計分析。應(yīng)用每百萬片段中來自某一基因每千堿基 reads 數(shù)目（RPKM）算法對每個樣本中基因的表達(dá)量進(jìn)行量化。當(dāng) RPKM 值大于 0.01 時被認(rèn)為該基因在組織中表達(dá)[50]。差異表達(dá)分析之前，運用 SPSS19.0 檢驗樣品間基因的表達(dá)模式相關(guān)性。采用 DESeq（version 1.18.0）對基因表達(dá)進(jìn)行差異分析，篩選差異表達(dá)基因條件為：表達(dá)倍

第三章 結(jié)果與分析組學(xué)分析A 提取結(jié)果了 3 只小尾寒羊和 3 只甘肅高山細(xì)毛羊的乳腺組織共 6 個樣A 的提取�？� RNA 的純度和濃度采用 NanoDrop 2000（Th）檢測，完整性采用 1.5 %甲醛變性的瓊脂糖凝膠電泳檢測�？� RNA 完整性較好，純度較高（檢測結(jié)果如圖 2）。本試驗 5S、18S 和 28S 三條帶，沒有其他雜帶，且無拖尾現(xiàn)象，無度檢測顯示 A260/A280 均處于 1.9~2.0 之間。RNA 文庫經(jīng)求，可用于后續(xù)試驗。

表 5 數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計Table 5 Statistical data filteringSample Clean resds Clean data Clean resds（%） CleanGB1_5 141244574 20882221354 99.23 GB2_8 139563102 20659945012 99.36 GB3_4 139407058 20516397494 99.26 XB1 140828556 20773788910 99.30 XB2_7 136465766 20125833522 99.33 XB3_8 136990336 20195805086 99.19 ：Sample：樣品名；其中，GB 為哺乳期甘肅高山細(xì)毛羊乳腺組織，XB 為哺乳期小尾寒羊乳腺組織；Clean Reads：高質(zhì)量序列 read 數(shù)；Clean Data（bp）：高質(zhì)量序列堿基數(shù)；Clean Reads %：高質(zhì)量序列 reads 占測序 reads 的百分比；Clean Data %：高質(zhì)量序列堿基占測序堿基的百分比；通過單堿基質(zhì)量、Base Content分布、GC Content分布和Sequence Ba布對測序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量評估。測序數(shù)據(jù)的單堿基質(zhì)量分布圖是用來評堿基的測序準(zhǔn)確性。一般測序的 5'端和 3'端的堿基質(zhì)量較低，中間部序質(zhì)量較高。對測序結(jié)果質(zhì)控分析發(fā)現(xiàn)，大部分序列的堿基質(zhì)量在 Q明堿基識別準(zhǔn)確率在 99 %以上，測序質(zhì)量可行度較高（圖 3）。

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本文編號：2807836