空腸彎曲菌是全世界范圍內(nèi)引起細(xì)菌性腹瀉病的最常見(jiàn)病原菌之一,防治空腸彎曲菌的有效手段主要是抗生素,但是2017年WHO發(fā)布指導(dǎo)新型抗生素研發(fā)的優(yōu)先考慮耐藥致病菌名單,其中將氟喹諾酮類抗生素耐藥的彎曲菌定為二類高度重要病原菌,這說(shuō)明急迫需要建立對(duì)彎曲菌新的防控方法。本研究中以空腸彎曲菌保守的黏附蛋白Peb1為靶標(biāo),通過(guò)虛擬篩選生物活性廣泛的中藥小分子,并構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白rPeb1,制備其單克隆抗體,在此基礎(chǔ)上通過(guò)體外黏附模型篩選可抑制Peb1黏附的中藥小分子,并進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),以期能夠找到抑制空腸彎曲菌黏附侵襲定殖的中藥小分子用于空腸彎曲菌的防控。一、虛擬篩選與空腸彎曲菌黏附蛋白Peb1結(jié)合的中藥小分子通過(guò)查找蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)和同源建模篩選具有可信的三維結(jié)構(gòu)的空腸彎曲菌毒力因子,確定已有晶體結(jié)構(gòu)解析的黏附蛋白Peb1為靶標(biāo)蛋白。鑒于中藥有廣泛的生物學(xué)活性,選擇中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫(kù)TCMDatabase中的4918種類藥性小分子為配體庫(kù)。通過(guò)預(yù)測(cè)活性口袋,比較預(yù)測(cè)的Cavity與Peb1蛋白自帶配體天冬氨酸的空間位置,確定體積較大、中心較深的Cavity_4為本次實(shí)驗(yàn)的對(duì)接中心。使用Autodock Vina軟件進(jìn)行虛擬篩選,結(jié)果顯示有4903種小分子可以與Peb1蛋白自發(fā)發(fā)生反應(yīng),且其中親和力絕對(duì)值大于等于6kcal/mol的高評(píng)分化合物有3125種,占所有進(jìn)行虛擬篩選的小分子的63.54%,親和力絕對(duì)值大于等于8 kcal/mol的小分子有134種,占所有進(jìn)行虛擬篩選的小分子的2.72%,將其定為潛在有效小分子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)篩選,比常規(guī)藥物高通量篩選的效率更高,這說(shuō)明中藥小分子確實(shí)是值得篩選、深入研究的。二、空腸彎曲菌黏附蛋白Peb1單克隆抗體的研制為建立Peb1蛋白體外黏附模型,研制Peb1單抗。將peb基因分別連入表達(dá)載體pColdI和 pGEX-6p-1 中,構(gòu)建重組菌 BL21(DE3)(pColdI-pbb1)和 BL21(DE3)(pGEX-6p-1-pbb1)。重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo),親和層析柱純化后獲得表達(dá)產(chǎn)物;并通過(guò)甘氨酸-鹽酸溶液提取空腸彎曲菌含有天然Peb1蛋白的混合蛋白。以純化蛋白rHis-Peb1為免疫原,rGST-Peb1和含天然Peb1的空腸彎曲菌甘氨酸粗提物為檢測(cè)原,應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備Peb1單克隆抗體。通過(guò)間接ELISA方法,篩選獲得6株穩(wěn)定分泌抗Peb1蛋白的單克隆雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1D6、2A5、3B5、4E1、4F8和5B9,其腹水效價(jià)均達(dá)到1:2000000以上,均為IgG1亞類。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示本研究制備的6株單克隆抗體可特異性識(shí)別天然Peb1蛋白,并與空腸彎曲菌的標(biāo)準(zhǔn)株及分離株均有良好的陽(yáng)性反應(yīng),表明6株P(guān)eb1單克隆抗體具有良好的反應(yīng)性,可用于檢測(cè)Peb1蛋白,這為研究建立空腸彎曲菌病原檢測(cè)、Peb1功能研究等方面提供了條件。三、空腸彎曲菌Peb1蛋白黏附抑制劑的驗(yàn)證和評(píng)估為篩選空腸彎曲菌Peb1蛋白的黏附抑制劑,建立了 rPeb1對(duì)Hela-MEF的體外黏附模型。用3μg/mL Hela-MEF 4℃過(guò)夜包被受體,1 μg/mL黏附素rPeb1提前與中藥小分子共孵育后,加入體外黏附ELISA篩選體系中篩選Peb1的黏附抑制劑,確定穗花杉雙黃酮可抑制Peb1的黏附,且呈現(xiàn)濃度梯度劑量依賴關(guān)系,故選擇穗花杉雙黃酮進(jìn)行后續(xù)研究。通過(guò)微量肉湯稀釋法發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮對(duì)空腸彎曲菌的SIC為256 μg/mL,趨化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)空腸彎曲菌對(duì)0.1 mM穗花杉雙黃酮無(wú)趨避現(xiàn)象;通過(guò)MTT法確定0.1 mM穗花杉雙黃酮不影響Hela細(xì)胞活性。穗花杉雙黃酮對(duì)空腸彎曲菌黏附細(xì)胞雖無(wú)顯著性作用但有抑制趨勢(shì),并能顯著抑制空腸彎曲菌侵襲(p0.05)。鑒于黏附作用和Peb1蛋白在空腸彎曲菌生物被膜的關(guān)聯(lián),同時(shí)探究穗花杉雙黃酮對(duì)空腸彎曲菌生物被膜的影響,發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮可顯著性抑制空腸彎曲菌生物被膜的形成,且呈現(xiàn)濃度梯度劑量依賴關(guān)系。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明穗花杉雙黃酮對(duì)防控空腸彎曲菌有一定作用,但仍需要探索更有效的抗黏附或抗毒力化合物進(jìn)行防控空腸彎曲菌。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

碩士學(xué)位論文化時(shí)將ＭＣＰｓ與ＣｈｅＡ連接起來(lái)。在一些菌株中，ＣｈｅＷ可被ＣｈｅＶ代替。與鞭毛馬達(dá)的ＦｌｉＭ成分結(jié)合，使旋轉(zhuǎn)方向從逆時(shí)針變成順時(shí)針，從而使運(yùn)動(dòng)變?yōu)閭?cè)向翻滾運(yùn)動(dòng)并改變運(yùn)動(dòng)方向。ＣｈｅＹ隨后被ＣｈｅＺ去磷酸化，從而整個(gè)過(guò)程由ＣｈｅＲ調(diào)控，它可使ＭＣＰｓ甲基化以增強(qiáng)其激活ＣｈｅＡ的能力。ｅＢ使ＭＣＰｓ去甲基化，從而降低了它們激活ＣｈｅＡ的能力，使系統(tǒng)恢復(fù)到５］。ＣｈｅＹ則作為效應(yīng)調(diào)節(jié)因子在鞭毛旋轉(zhuǎn)中起著核心作用，ＣｈｅＰ和ＣｈｅＱ錄調(diào)控因子對(duì)趨化核心基因的轉(zhuǎn)錄具有重要的調(diào)控作用［６６］。破壞受體－ＣｈｅＡ鞭毛這一趨化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的任一組成部分，或者缺失一個(gè)化學(xué)感應(yīng)受體，低空腸彎曲菌對(duì)各種動(dòng)物宿主的定殖和致病能力（６７］�？偟膩�(lái)說(shuō)，鞭毛及其空腸彎曲菌黏附在腸道表面并成功定殖具有重要作用。逡逑

基于Ｐｅｂｌ蛋白抑制空腸彎曲菌黏附的中藥小分子篩選與評(píng)估邐逡逑。雖然其他病原菌的ＣＤＴ被證實(shí)能夠逆行通過(guò)高爾基體反面膜囊網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)逡逑最終進(jìn)入細(xì)胞核（圖３），但空腸彎曲菌的ＣＤＴ卻有２個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題需要解決：首先，逡逑彎曲菌的ＣＤＴ的逆行運(yùn)輸既不依賴Ｄｅｒｌｉｎ－２也不依賴Ｅ３邋ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｌｉｇａｓｅ逡逑ｄｌ）［８９］；此外，空腸彎曲菌的ＣｄｔＢ核定位信號(hào)（ＮＬＳ）未有實(shí)驗(yàn)確定。雖然機(jī)理研究不清逡逑但實(shí)驗(yàn)證明ＣＤＴ能誘導(dǎo)白細(xì)胞產(chǎn)生ＩＬ－８并促進(jìn)趨化，從而在宿主腸道中誘發(fā)炎癥逡逑，所以被認(rèn)為是一種免疫調(diào)節(jié)劑。在ＮＦ－ｋＢ缺陷小鼠致病模型中，也確定了邋ＣＤＴ誘癥反應(yīng)以及對(duì)空腸彎曲菌在宿主體內(nèi)定殖侵襲等方面的重要作用［９１］。逡逑Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ逡逑

逡逑２．２邋Ｐｅｂｌ蛋白結(jié)構(gòu)的獲取逡逑從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)ＰＤＢ獲取ＩＤ為２Ｖ２５的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)（圖１－１），該晶體是二聚體，逡逑具有典型的ａ－螺旋－Ｐ－折疊雙結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，此外還含有配體小分子天冬氨酸、鋅離子。逡逑圖Ｍ空腸彎曲菌黏附蛋白Ｐｅｂｌ晶體結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇ．邋１－邋１邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ邋ｊｅｊｕｎｉ邋ａｎｔｉｇｅｎ邋Ｐｅｂｌ逡逑２．３受體蛋白Ｐｅｂｌ的處理逡逑獲得經(jīng)剝離并除去鋅離子和天冬氨酸小分子配體的Ｐｅｂｌ單體結(jié)構(gòu)（圖１－２），在Ｐｙｍｏｌ逡逑中展示ｃａｒｔｏｏｎ模式。逡逑圖１－２邋Ｐｅｂｌ蛋白單體結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋Ｐｅｂｌ邋ｍｏｎｏｍｅｒ逡逑

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