鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌(Riemrella anatipestifer,RA)引起的一種主要侵害雛鴨、雛火雞、鵝等多種禽類的急性或慢性、敗血性、接觸性傳染病。感染鴨發(fā)病率高達90%、死亡率高達75%,對世界養(yǎng)鴨業(yè)造成重大經濟損失。RA屬于擬桿菌門,黃桿菌屬,無鞭毛和菌毛,而擬桿菌門有多種菌都存在滑行運動的現(xiàn)象�；蚍治霭l(fā)現(xiàn)RA同樣存在著滑行運動基因,同時還存在一整套的新型分泌系統(tǒng)即IX型分泌系統(tǒng)(the type IX secretion system,T9SS)基因,該系統(tǒng)在擬桿菌門中普遍存在且高度保守。在前期研究中我們用轉座子隨機突變技術篩選到一株Yb2AS87_RS08465基因突變株,發(fā)現(xiàn)其毒力顯著減弱,但具體的機制并不清楚�；虮葘Ψ治霭l(fā)現(xiàn)AS87_RS08465編碼細菌滑行運動和IX型分泌系統(tǒng)核心組分蛋白GldM。通過Western blot鑒定到該蛋白位于RA的細胞膜上。瓊脂糖凝膠擴散試驗證實了野生株Yb2存在著滑行運動,而突變株的滑行運動能力喪失。進一步的研究表明突變株RA2281(又稱Yb2ΔgldM)的黏附和入侵細胞的能力顯著降低,此外,突變株Yb2ΔgldM感染雛鴨的血液載菌量顯著低于相同劑量野生株感染雛鴨的載菌量,表明AS87_RS08465基因對RA感染雛鴨的致病性至關重要。經轉錄組測序發(fā)現(xiàn),突變株Yb2ΔgldM有15個基因上調表達,其中有6個上調表達倍數(shù)在2倍以上、下調表達基因15個,其中有5個下調2倍以上,且部分基因也是IX型分泌系統(tǒng)的組分,提示這些成分之間存在著功能上的聯(lián)系。本研究表明GldM蛋白與RA滑行運動有關,且對RA感染鴨的致病性有著關鍵作用。提取野生株Yb2、突變株Yb2ΔgldM和回復株cYb2ΔgldM的分泌蛋白,SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)突變株Yb2ΔgldM在分泌蛋白的豐度和含量上較Yb2和回復株cYb2ΔgldM有很大的區(qū)別,Yb2ΔgldM分泌蛋白的酶活試驗也證實其酶降解能力顯著降低,表明突變株缺失了分泌某些關鍵酶分子的能力。質譜分析結果顯示Yb2ΔgldM的分泌蛋白與Yb2相比,具有顯著性的差異,這些差異蛋白有9個含有特異性CTD結構,是IX型分泌系統(tǒng)的分泌底物。基因功能注釋顯示這9個蛋白很多都是具有催化活性的酶類,可能是RA重要的潛在毒力因子。本研究證明了GldM蛋白與RA的滑行運動、IX型分泌系統(tǒng)及蛋白分泌有關。
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.61
【圖文】：

spr 及其同源性基因在擬桿菌門中的分布Fig 1.1 Distribution of gld and spr orthologs in completed Bacteroidetes genom(Mcbride and Yongtao, 2013)泌系統(tǒng)力因子的釋放有賴于專屬的分泌系統(tǒng)，自 1982 年 Goebel W 等(G現(xiàn)革蘭氏陰性菌大腸桿菌依賴分泌系統(tǒng)分泌毒力因子溶血素 A 以種蛋白質分泌系統(tǒng)，包括：I 型、II 型、III 型、Ⅳ型、V 型、Ⅵ型泌系統(tǒng)一般都橫跨細菌的內膜，周質和外膜，不同分泌系統(tǒng)的分Ⅳ型、Ⅵ型分泌系統(tǒng)的分泌物在胞內合成后可直接穿過細胞膜孔II 型、V 型則是先通過內膜的雙精氨酸轉運途徑（Sec/Tat system至周質，再通過外膜轉運系統(tǒng)將底物運送至相應位置，這種方015)，Ⅶ型、Ⅷ型則與細菌的Ⅰ型菌毛和 curli 蛋白分泌有關(De菌的繁殖傳播和適應環(huán)境有著重要的生理作用，它們能夠促進細、抵御宿主的抗菌系統(tǒng)，抵御生物和化學試劑的殺傷以及在真核

數(shù)細菌降解幾丁質的關鍵酶(Rhodes, et al., 2011)�；羞\動研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)，很多無滑行運動的菌中同樣存在著 gld 基碼產物，這提示了該類基因存在更多功能上的潛力。牙齦卟啉單胞菌(Por)也是擬桿菌門的成員，但無滑行運動能力，缺乏傳統(tǒng)的分泌系統(tǒng)，但該菌分的毒力因子，可引起人的牙周疾病，Keiko S 等通過基因組序列分析和比對泌與十一種蛋白有關，包括 PorK, PorL, PorM, PorN, PorW, PorT, PorX , PorY, rN, PorP 和 Sov 等。有趣的是，這十一個蛋白中有七個蛋白(PorK, PorL, P，PorT) 與約氏黃桿菌的滑行運動相關蛋白在序列上有著極高的相似度，并且缺失后牙齦卟啉單胞菌不能正常分泌牙齦素，而當約氏黃桿菌 porT 的同源基的滑行運動，ChiA 的分泌及細胞表面與滑行運動相關的蛋白 SprB 分泌都出在擬桿菌門中存在著某種特殊的蛋白分泌系統(tǒng)且這種分泌系統(tǒng)和細菌的滑行并將這種分泌系統(tǒng)稱之為 Por 分泌系統(tǒng)(PorSS)(Sato, et al., 2010)。2013 年，M性分析比對了擬桿菌門中的幾十種菌，發(fā)現(xiàn) Por 分泌系統(tǒng)存在于該門的大多該分泌系統(tǒng)組分在擬桿菌門中高度保守，系統(tǒng)組分和分泌底物特點都與其 I有著顯著差異，并與細菌的致病能力相關，因此將其命名為一種新的分泌系，該分泌系統(tǒng)為擬桿菌門所特有(Mcbride and Yongtao, 2013)。

碩士學位論文 泌系統(tǒng)之所以區(qū)別于其他八種分泌系統(tǒng)，是因為其分泌底物蛋白的方是分泌蛋白氨基端具有信號肽結構，該結構使蛋白能夠被內膜 Sec 系周質，另一個更重要的特點是在分泌蛋白的羧基端含有一段大約 60-1稱之為 CTDs，該結構在外膜被Ⅸ型分泌系統(tǒng)所識別并切割，從而使胞表面(Abhishek, et al., 2013; Glew et al., 2012; Keiko et al., 2012; Seer表明，所有的CTDs都屬于TIGRFAM家族，該家族分為TIGR04131 和統(tǒng)所分泌的外分泌蛋白 ChiA、牙齦素等屬于 TIGR04183，也叫 A 型動相關蛋白 SprB、RemA 等屬于 TIGR04131，也叫 B 型 CTDs(Abhish012; Mcbride and Yongtao, 2013)。對分泌蛋白來說，CTDs 是分泌蛋白旦蛋白的 CTDs 結構損傷或是Ⅸ型分泌系統(tǒng)損傷，雖然這種損傷并不泌蛋白都不能分泌至胞外，從而造成蛋白在細胞周質內的聚集(Glew, e更多菌種的研究進一步闡明了擬桿菌門的這種新型分泌系統(tǒng)的機制。

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本文編號：2807273