【摘要】：牛支原體是導(dǎo)致牛的多種疾病綜合癥的病原體之一,并給養(yǎng)牛業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。但是,由于缺乏有效的基因操作工具,關(guān)于牛支原體的致病機理的研究相對較少。 作為功能性的DNA復(fù)制起始元件,oriC基因序列已經(jīng)在多種支原體中得到應(yīng)用,但是尚無在牛支原體中應(yīng)用的報道。本研究利用牛支原體的oriC序列構(gòu)建了可以轉(zhuǎn)染牛支原體的載體系統(tǒng)。通過截短試驗,找到牛支原體oriC最小的功能域,該區(qū)域富含A+T,并且包含兩個dnaAbox。通過穩(wěn)定性實驗檢測,本研究構(gòu)建的oriC載體轉(zhuǎn)化株經(jīng)過30次傳代,載體仍然能夠以質(zhì)粒的形式穩(wěn)定存在,而沒有整合到牛支原體的基因組中。即使在無抗性篩選的條件下,轉(zhuǎn)化株經(jīng)30次傳代仍然能夠攜帶質(zhì)粒。另外,該載體系統(tǒng)能夠在牛支原體中成功表達由LacZ報告基因編碼的外源蛋白p-半乳糖苷酶,以及同F(xiàn)LAG標簽蛋白融合表達的內(nèi)源蛋白。同時,利用Western blot驗證了該oriC自我復(fù)制載體具有作為過表達載體使用的潛能。 牛支原體沒有細胞壁,因此細胞膜對于其生長、繁殖以及黏附宿主細胞起著至關(guān)重要的作用。為了探究牛支原體膜蛋白以及膜相關(guān)蛋白的基因功能,利用該載體系統(tǒng),分別構(gòu)建了MBOVPG45_0790蛋白和P48蛋白過表達牛支原體菌株,通過間接免疫熒光方法與流式細胞術(shù)分別比較了牛支原體PG45標準株、MBOVPG45_0790蛋白過表達株和P48蛋白過表達株對牛腎細胞的黏附與誘導(dǎo)凋亡的作用。MBOVPG45_0790蛋白過表達株和P48蛋白過表達株對牛腎細胞的黏附以及誘導(dǎo)凋亡的程度與對照組無明顯差異,顯示了這兩種蛋白的單一過表達不會對牛支原體黏附及誘導(dǎo)牛腎細胞凋亡產(chǎn)生影響。 綜上,本研究利用復(fù)制起始元件oriC、啟動子元件prvVSPA以及抗性基因元件tetM成功的構(gòu)建了應(yīng)用于牛支原體的自我復(fù)制載體系統(tǒng),并且優(yōu)化了該系統(tǒng)的大小及轉(zhuǎn)化條件。利用該系統(tǒng)在牛支原體中成功的表達了外源及內(nèi)源蛋白。同時,檢測了兩種細胞膜相關(guān)蛋白對牛腎細胞的黏附及誘導(dǎo)凋亡的影響。隨著牛支原體基因組序列拼接的完成,構(gòu)建的自我復(fù)制載體系統(tǒng)為研究牛支原體相關(guān)基因的功能及致病機理提供了良好的平臺。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.62
【圖文】：

發(fā)現(xiàn)的有機體是一種病毒或者是L型細圼[3]。由于生長在固體平板培養(yǎng)基上的支原體在顯微鏡下觀察呈現(xiàn)典型的“煎蛋”狀圼落（圖1-1)，因此對支原體的分類爭議一直持續(xù)到二十世紀60年代[3]0Sectioned colortyf Central zonePeripheral mm 《}0be_d in agar)(agar surface)\ ^ ? * ? ? ? ? \{ * ? ? ? I\ ? ? \t\wy ? ? /V ? ? ? ? ? * tt g?????.? ^Surface of colonyC^fffed tgg" appearance)圖1-1支原體“煎蛋”狀形態(tài)的圖解⑷Figure 1-1 Diagram of “fried-egg” morphology⑷事實上，支原體屬于柔膜菌綱、支原體R、支原體科[5-7]，是柔膜菌綱中最大的種屬。柔膜菌是?類由革蘭氏陽性細菌分支演化而來的，沒有細胞壁的微生物[8'9]。通常人們會認為，沒有細胞壁的微生物應(yīng)該屬于革蘭氏陰性菌。盡管如此，柔膜菌綱的微生物在進化學角度與革蘭氏陽性菌更為相關(guān)，即桿菌綱和梭菌綱。16S rRNA序列同源性分析是最常用的細菌進化樹分析方法[">“\盡管存在數(shù)十年的爭論

細胞質(zhì)巾生存[91]。盡管關(guān)于支原體逃避宿主吞唾作用的以上所有方法尚沒有全部確認，但在牛支原體的入侵中，其很可能是利用以上方式[91]。圖1-3顯示了支原體是如何在宿主細胞吞II過程的各階段中逃避的[911。Extr^^lular Z ^/ b、-\ (p) \彟” I \ (b)/ 丨 ntfac?丨 Mar圖1-3支原體在逃避宿主吞唾作用的各階段(a)支原體的炥附和存j作用可能被纖維所組成的結(jié)構(gòu)，抗存噴蛋的存在或莢膜結(jié)構(gòu)所抑制，也Bj■能是由r其、免疫球蛋白Fc蛋白的結(jié)合或定殖在纖毛和細胞質(zhì)見使其難以到達存晚細胞所致；（b)支原體的蛋m酶、a愔琠和產(chǎn)生的氧化自由基可能會影響吞唾體膜結(jié)構(gòu)的完整性，呼吸道吞唾細胞的新陳代謝和活性；（C)支原體產(chǎn)生的l#類物質(zhì)可能會對吞唾體-溶》體結(jié)合物造成損害；（d)支原體可能會從吞哩作用中存活下來，逃避至細胞質(zhì)中（機制尚不明確）；(e)支原體在吞唾體-溶酶體結(jié)合物中存活下來是太可能的[91】。6

響因素是否會對疾病的狀況產(chǎn)生影響尚不明確[“7】。基于以上這些報道，污染物可能是牛支原體感染的重要來源。圖1-4是Maunsell和Donovanl8、！出的牛支原體傳播方式及秘牛的傳染病動力學。mm. a. ^Mfosols， /蔡II gF^eiiBSpf前df卿師 Kyj^Jmm圖1-4牛支原體在j牛中的傳播和感染動力學Figure 1-4 Proposed Transmission and infection dynamics in young calves (URT, upper respiratory tract)[R[支)?體所引起的呼吸道疾病，即使在臨床上沒有明顯的感染癥狀，感染動物可能會作為帶菌者向外持續(xù)散布病原數(shù)月甚至數(shù)年lis]。呼吸道感染的傳播途徑可能是直接接觸、飛沫、氣溶膠或依靠自然風力傳播115]。患有有牛支原體感染引起的乳房炎的乳卞?所懷胎兒和生產(chǎn)後牛會通過母體子宮或者在出生過程中感染，證明了牛支原體垂直傳播的可能性同時，也有報道證明了接牛見的橫向傳播另外，感染的擴散也可能在器宮之間發(fā)生[I2、在這些報道中，乳房炎和關(guān)節(jié)炎的發(fā)生都是在呼吸系統(tǒng)產(chǎn)生疾病之后有許多試驗研究農(nóng)明，將接牛、小母牛和成牛乳牛詞養(yǎng)在一起時，當有明顯的呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生后大約一個月，成年母牛發(fā)生乳房炎，而接牛和小母�；加嘘P(guān)節(jié)炎盡早對感染動物進行診斷，挑選出帶菌動物和患病動物

【共引文獻】

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本文編號：2807091