【摘要】：豬蛔蟲(Ascaris suum)是一種寄生線蟲,在分類上隸屬線蟲綱(Nematoda)、蛔目(Ascaridata)、蛔科(Ascaridae)、蛔屬(Ascaris),在全球廣泛流行,豬群感染率高達50%-70%。成蟲寄生于豬小腸腸腔內(nèi),在豬體內(nèi)寄生的數(shù)量巨大,可達1000條以上,常引起腸腔堵塞,擾亂機體的消化吸收,導致消瘦、出血及生長不良。據(jù)估計雌性成蟲每天的產(chǎn)卵量可多達20萬到200萬個。豬蛔蟲幼蟲在豬體內(nèi)移行會損傷肺臟和肝臟,并引起其他繼發(fā)性疾病,導致幼齡豬死亡,嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。另外豬蛔蟲在很長時間內(nèi)被認為和人蛔蟲是一個種,豬蛔蟲幼蟲還會在人體寄生,引起眼幼蟲移行癥等。所以,對豬蛔蟲病的研究也具有重要公共衛(wèi)生學意義。MicroRNA (miRNA)是一類內(nèi)源性的非編碼小RNA,長度通常約18～22nt,廣泛存在于真核生物中,具有發(fā)育階段特異性、時序性或者組織特異性的表達特點,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)個體生長發(fā)育相關基因的表達。研究表明,寄生線蟲可以通過miRNA實現(xiàn)對宿主和自身基因表達的精確調(diào)控,提高感染和增殖的能力,逃避免疫監(jiān)視。對這種機制的充分了解和把握有助于更好地理解寄生線蟲的調(diào)控機理和性別分化機制,從而很可能成為免疫預防或化學治療的“關鍵”靶分子。為此,本文分別對豬蛔蟲和人蛔蟲成蟲期miRNA進行深度測序,并對兩者的表達譜比較分析；同樣,對豬蛔蟲不同發(fā)育期miRNA進行深度測序,對表達譜進行分析比較；最后,選取三個miRNA (miRNA-36、miRNA-100b、miRNA-81a)為研究對象,進一步研究其生物學功能。結果如下：一、豬蛔蟲與人蛔蟲成蟲期miRNA表達譜及比較分析采用深度測序獲得豬蛔蟲人蛔蟲成蟲miRNA表達譜數(shù)據(jù),我們從人蛔蟲豬蛔蟲成蟲樣品中分別獲得了171及494 miRNA候選者。其中74個miRNA是兩種蛔蟲共有的,97和420個miRNA是人蛔蟲豬蛔蟲特異的。靶基因及功能注釋分析顯示兩類蛔蟲的很多靶基因與卵巢信息蛋白,卵黃蛋白原和軟骨素蛋白多糖有關。富集分析顯示兩種蛔蟲的大多數(shù)miRNA靶基因是相似的,但是兩種蛔蟲靶基因數(shù)目不同,而某些功能如NADH脫氫酶及電子轉(zhuǎn)運功能等是豬蛔蟲特有的。豬蛔蟲人蛔蟲miRNA表達譜比較研究結果為豬蛔蟲人蛔蟲是一個種提供了一種證據(jù)。二、豬蛔蟲不同發(fā)育階段miRNA高通量測序及生物信息學分析建立了豬蛔蟲7個不同發(fā)育(包含蟲卵,肝階段L3期幼蟲,肺階段L3期幼蟲,L4期幼蟲,L5階段幼蟲,成熟雌性成蟲,成熟雄性成蟲)時期的文庫。高通量測序后共獲得8516852條unique reads。在7個階段分別共獲得565、215、157、128、174、486和498個miRNA,其中通過同源性分析分別有75、95、82、77、79、80和85個miRNA是已知的,其余都是新miRNA。通過比對分析獲得75個miRNA在7個發(fā)育階段共同表達,437個miRNA在胚胎期特異表達,還有一些在胚胎期表達量非常高,如asu-miR-44b和asu-miR-5350a,暗示它們可能與胚胎發(fā)育有關。165個miRNA是發(fā)育期特異表達的,asu-miR-184、asu-miR-5348、 asu-miR-5351、asu-miR-5352、asu-miR-5367和asu-miR-72在L3期表達量特別高,可能與三期幼蟲的感染性有關。還有一些miRNA在兩個相鄰階段表達非常高,推測與發(fā)育期過渡有關,如asu-miR-239、asu-miR-279c、asu-miR-5357、 asu-miR-5364和prd-let-7可能與幼蟲到成蟲期過渡有關。RNAhybrid預測共得到1291個靶基因,GO分析發(fā)現(xiàn)很多靶基因在豬蛔蟲生長發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用,如與線蟲發(fā)育及壽命有關的,胚胎發(fā)育,蛻皮,發(fā)育期過度,生殖,產(chǎn)卵,遷移,形態(tài)改變等,富集分析顯示預測靶基因主要集中在催化及結合功能,其次是生物進程,細胞進程,代謝進程,發(fā)育進程。選擇3個卵階段特異表達的miRNA及5個所有發(fā)育階段共表達的miRNA進行了熒光定量分析,結果顯示5個階段共表達miRNA的定量結果與預測均相符,卵時期特異表達的3個miRNA與測序結果不符。三、豬蛔蟲三個miRNA的功能特征初步研究設計合成了3個miRNA (miRNA-36, miRNA-100a, miRNA-81a)的1nimic、 inhibitor及相應的陰性對照,通過浸泡的方式導入蛔蟲幼蟲體內(nèi),用熒光定量來檢測miRNA及其靶基因的豐度變化。每個miRNA的功能用豬蛔蟲幼蟲的感染率及其從小鼠肝、肺回收的豬蛔蟲蟲體長度和寬度來評價。miRNA mimic浸泡進入后的蟲體的相應miRNA的表達水平上升,抑制劑處理蟲體的相應miRNA的水平下降,表明通過浸泡可以成功導入miRNA的mimic及inhibitor。miRNA mimic的導入在體內(nèi)不發(fā)揮明顯的功能效果,蟲體的感染力生長發(fā)育沒有明顯變化,表明內(nèi)源miRNA的表達水平可以維持蟲體的正常的發(fā)育。miRNA-36 inhibitor處理組每只小鼠的幼蟲感染量為71.40±25.22個,明顯低于inhibitor陰性對照(170.89±12.45個)及空白組(230.30±17.47個),差異顯著(P0.05)；inhibitor處理組的蟲體長度為410.57±71.31μm,寬度為16.20±2.43μm,明顯低于陰性對照組及空白組(P0.01)。miRNA-100a inhibitor處理組每只小鼠的平均感染量為42.40±25.22個,與陰性對照(140.89±12.45μm)及空白(178.30±17.47μm)相比差異顯著；inhibitor組的豬蛔蟲平均長度為390.67±85.31μm,寬度24.89±2,47μm,與空白組(482.30±69.56μm,23.21±1.45μm)相比差異不顯著。miRNA-81a inhibitor處理組每只小鼠的平均感染量為123.40±12.22個,與陰性對照(90.89±15.45個)及空白(178.30±17.47個)相比差異不顯著。三種miRNA inhibitor都可以引起miRNA靶基因水平的上升。
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28
【圖文】：

邵長春：豬帕Ｉ蟲與人蛇１蟲成蟲及豬郵蟲不同發(fā)育期ｎｄＲＮＡ表巧譜比較及Ｅ個ｍｉＲＮＡ功能初步研究邐３逡逑ｔＲＮａｓｅＺ裂解并釋放ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡｓ，后續(xù)的合成過程類似于經(jīng)典合成途徑。藍氏賈第蟲的成途徑不同于Ｗ上幾種，ｍｉＲＮＡｓ是來源于通常用來修飾其它類型ＲＮＡ的ｓｎｏＲＮＡｓ，藍氏賈第蟲缺乏ｄｒｏｓｈａ及Ｅｘｐｏｒｔｉｎ－５，但是兩個重要ＲＩＳＣ組成成分ＡＧＯ及Ｄｉｃｅｒ在藍賈第串壬查查’說明藍竺琴３娌椴槁恚桑喝床晃ㄐ洌潁錚螅瑁幔模恚椋遙危梁閑┩揪敦�。辶x

本文編號：2805075