【摘要】：口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是一種嚴(yán)重危害畜牧業(yè)生產(chǎn)的烈性傳染病。2010年2月和2011年3月,O型緬甸98(Mya98)系和“新一輪”泛亞(PanAsia-1)系傳入我國(guó)后迅速擴(kuò)散,對(duì)我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了巨大影響。我國(guó)防控FMD采取免疫與撲殺相結(jié)合的綜合措施,免費(fèi)對(duì)所用家畜進(jìn)行滅活疫苗強(qiáng)制免疫,但因FMDV本身免疫原性弱,免疫持續(xù)期短,存在生物安全隱患,不利于FMD的凈化等因素的限制,使得FMD防控工作很難開(kāi)展。因此,更多的學(xué)者將目光投入了FMD基因工程疫苗的研究。本研究是將實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的豬O型FMD基因工程菌進(jìn)行工業(yè)化放大的生產(chǎn)工藝研究,通過(guò)檢驗(yàn)對(duì)各個(gè)工藝流程進(jìn)行效果評(píng)價(jià),建立一套成熟、穩(wěn)定的豬FMD O型復(fù)合表位蛋白疫苗的生產(chǎn)工藝流程。將保存菌種進(jìn)行形態(tài)、酶切、目的蛋白表達(dá)及Western blot鑒定。分別從誘導(dǎo)條件、培養(yǎng)基、接種量、pH、補(bǔ)料方式等因素進(jìn)行優(yōu)化,使單位體積內(nèi)培養(yǎng)液獲得最大菌體數(shù)量。采用濁度法測(cè)量發(fā)酵液的光密度,計(jì)算菌體重量,來(lái)分析各個(gè)優(yōu)化參數(shù)的效果。結(jié)果顯示:發(fā)酵培養(yǎng)最適培養(yǎng)時(shí)間為8h,誘導(dǎo)時(shí)間為8h,誘導(dǎo)溫度為37℃;培養(yǎng)基中最適磷酸鹽濃度為100mmol/L,微量元素溶液為1mL/L;最適接種量為5%,pH為7.0~7.2,裝液量30%;采用變指數(shù)-恒pH混合流加補(bǔ)料,補(bǔ)料液為氨水、甘油,其中甘油較葡萄糖更利于目的產(chǎn)物的獲得。采用中空纖維系統(tǒng)對(duì)菌體進(jìn)行收集,高壓均質(zhì)機(jī)不同壓力對(duì)菌體進(jìn)行破碎,對(duì)比破碎效果,將收集的包涵體通過(guò)裂解進(jìn)行了親和層析純化,用不同濃度的咪唑進(jìn)行洗脫,確定最佳的咪唑洗脫濃度為100 mM。分別選取不同溫度、不同稀釋速度對(duì)收集的純化蛋白進(jìn)行復(fù)性,通過(guò)檢驗(yàn)復(fù)性后蛋白質(zhì)的活性、濃度,確定最佳復(fù)性條件。最后進(jìn)行過(guò)濾除菌分裝。將獲得的抗原樣品進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn),通過(guò)BCA法檢驗(yàn)蛋白濃度約為1 mg/mL,通過(guò)凝膠法檢驗(yàn)蛋白內(nèi)毒素含量小于50 EU/mL,利用間接血凝法檢驗(yàn)蛋白活性為1:1024,表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析蛋白分子量為25.5ku,采用Image Lab軟件分析蛋白純度90%以上,Western Blot方法檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上與牛FMDV陽(yáng)性血清反應(yīng),具有良好的反應(yīng)性。參照現(xiàn)有口蹄疫滅活疫苗乳化工藝,選用ISA 206和ISA 201 VG油佐劑,分別用4.6:5.4、1:1、5.4:4.6的水相和油相比例進(jìn)行乳化,制備疫苗。于2~8℃保存15個(gè)月,分別于第3、6、9、12、15個(gè)月取樣,進(jìn)行疫苗物理性狀檢驗(yàn),并進(jìn)行效力對(duì)比。結(jié)果顯示:疫苗水相和油相最佳配制比例為1:1。疫苗的外觀、劑型、穩(wěn)定性和黏度均符合產(chǎn)品的質(zhì)量要求,兩種油佐劑制備的乳劑均能誘導(dǎo)免疫豬產(chǎn)生1:64以上的抗體,ISA 201 VG佐劑疫苗免疫豬產(chǎn)生抗體水平高于ISA 206油佐劑,ISA 201 VG佐劑各免疫劑量組均獲得全保護(hù)。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S859.53
【圖文】：

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 博士學(xué)位論文 第一章 口蹄疫基因工程疫苗研究進(jìn)展廣。隨著工藝技術(shù)的要求，切向流過(guò)濾 (TFF) 系統(tǒng)目前正在進(jìn)入生產(chǎn)工藝。對(duì)于會(huì)快速堵塞死端過(guò)濾儀器的分離液體來(lái)說(shuō)，切向流過(guò)濾是一種有效的解決方法。使用切向流過(guò)濾時(shí)，大多數(shù)處理液會(huì)順著膜表面流動(dòng)，而不是通過(guò)膜結(jié)構(gòu)。液體會(huì)以與膜表面平行的相對(duì)較高的速度被泵送出。除了水處理應(yīng)用外，順著膜表面的切向流只有一小部分會(huì)被滲透。比如，在多數(shù)細(xì)胞和顆粒分離中，只有 1%~5% 進(jìn)樣到膜設(shè)備的流量會(huì)成為滲透液，剩下的 95%~99% 會(huì)退出膜設(shè)備成為“保留”。保留液會(huì)再循環(huán)至處理容器和組件入口，其中的 1%~5%會(huì)再作為滲透液被移除。再循環(huán)處理以快速連續(xù)的方式進(jìn)行，產(chǎn)生一個(gè)顯著、持續(xù)的滲透率 (見(jiàn)圖 1-1)。

傳統(tǒng)過(guò)濾

結(jié)果.1 BL21-FMDV-B4 的鑒定.1.1 BL21-FMDV-B4 形態(tài)鑒定菌種 BL21-FMDV-B4 檢驗(yàn)結(jié)果，菌落形態(tài)（圖 2-2A）、革蘭氏染色細(xì)菌態(tài)（圖 2-2B）均符合規(guī)定。圖 2-1 菌體干重與細(xì)菌密度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2-1 The standard curve of the relationship between the dryweight of the mycelium and the density of bacteria

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 吳彬;裴智鵬;成騁;吳斌;何冰芳;;利用指數(shù)流加補(bǔ)料高密度發(fā)酵產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶重組大腸桿菌[J];微生物學(xué)通報(bào);2017年04期

2 ;口蹄疫新型換代疫苗研制取得突破進(jìn)展[J];今日畜牧獸醫(yī);2016年01期

3 田康明;爾昊;路福平;王正祥;;磷酸鹽精確控制策略提升大腸桿菌生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成效率[J];食品工業(yè)科技;2016年01期

4 史素云;楊志彪;;豬O型口蹄疫的新型合成肽疫苗和傳統(tǒng)滅活疫苗的比較[J];農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)與裝備;2015年04期

5 張敏;張遠(yuǎn);童榮生;;天然提取與重組高遷移率組蛋白N2的抗乙型病毒性肝炎病毒活性比較[J];中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志;2015年05期

6 任婷月;周萬(wàn)里;張利群;畢春元;李敬龍;;一種檢測(cè)葡萄糖氧化酶活力的新方法[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2015年01期

7 趙小偉;楊永新;程廣龍;黃冬維;趙輝玲;;牛源大腸桿菌不同生長(zhǎng)階段的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2014年08期

8 李煒;楊桂林;李美忠;曾積蘭;;艱難梭狀桿菌重組腸毒素A和B與對(duì)應(yīng)天然腸毒素蛋白的功能活性比較[J];江西醫(yī)藥;2014年07期

9 王樹(shù)成;王新武;劉環(huán);;世界動(dòng)物衛(wèi)生組織對(duì)口蹄疫區(qū)域化的要求[J];中國(guó)動(dòng)物檢疫;2014年01期

10 戴波濤;趙剛;;獸用疫苗佐劑研究現(xiàn)狀[J];現(xiàn)代畜牧獸醫(yī);2013年02期

本文編號(hào)：2802357