發(fā)布時(shí)間：2020-08-13 13:16

【摘要】：背景及目的抗生素耐藥已經(jīng)成為全球普遍關(guān)注、亟待解決的重大問題。中國是抗菌藥物不合理應(yīng)用情況較為嚴(yán)重的國家之一,細(xì)菌耐藥形勢十分嚴(yán)峻,面對耐藥菌引起的健康威脅,迫切需要加強(qiáng)多領(lǐng)域合作以協(xié)同謀劃、共同應(yīng)對。在“One-Health”觀點(diǎn)中,環(huán)境處于“動物-環(huán)境-人類”這一整體的中心,在耐藥菌的傳播過程中扮演著重要角色,不僅可作為耐藥基因和耐藥菌的儲存庫,同時(shí)還是它們傳播的重要途徑。在環(huán)境領(lǐng)域,目前關(guān)于耐藥菌的研究多集中于單一環(huán)境介質(zhì),缺乏環(huán)境中多介質(zhì)傳播的整體性研究。在中國畜禽養(yǎng)殖區(qū),由于缺少處理禽畜糞便的專門設(shè)施,導(dǎo)致養(yǎng)殖廢棄物直接排放到周圍環(huán)境中。因此,在我國目前的養(yǎng)殖模式下,畜禽廢棄物的不合理處置會導(dǎo)致養(yǎng)殖周邊環(huán)境哪些介質(zhì)中出現(xiàn)耐藥菌,及其在環(huán)境多介質(zhì)中的潛在傳播規(guī)律,成為當(dāng)前環(huán)境領(lǐng)域耐藥菌研究急需闡明的問題。多粘菌素曾被認(rèn)為是治療銅綠假單胞桿菌、肺炎克雷伯桿菌、鮑氏不動桿菌等一系列革蘭氏陰性菌感染的最后防線,但隨著抗生素濫用,導(dǎo)致多種細(xì)菌均能攜帶粘菌素抗性基因mcr-1,使得這一觀點(diǎn)受到嚴(yán)重沖擊。雖然目前研究發(fā)現(xiàn)mcr-1僅導(dǎo)致中低程度的粘菌素耐藥,但并不能認(rèn)定其沒有繼續(xù)發(fā)展甚至導(dǎo)致高水平耐藥的風(fēng)險(xiǎn)。綜上,為掌握我國農(nóng)村家庭式養(yǎng)殖地區(qū)環(huán)境中攜帶mcr-1的大腸埃希菌的流行病學(xué)特征,本研究對山東省農(nóng)村家庭式養(yǎng)殖地區(qū)的多種環(huán)境介質(zhì)(水、土壤、蔬菜等)展開調(diào)查,探討攜帶mcr-1的大腸埃希菌分布情況及分子生物學(xué)特征,為制定細(xì)菌感染性疾病的相關(guān)防控策略和措施提供理論依據(jù)。方法本研究于2015年7月開始進(jìn)行,統(tǒng)一收集了山東省某家庭式養(yǎng)殖地區(qū)的12個(gè)村莊的環(huán)境樣品,包括豬糞便、廢水、排污口沉積物、飲用水、河水、河流沉積物、土壤、蔬菜;通過分離、篩選和鑒定耐藥菌,分離出攜帶mcr-1基因的大腸埃希菌;通過藥敏試驗(yàn)確定菌株的耐藥表型;通過脈沖場凝膠電泳(PFGE)和多位點(diǎn)序列分型(MLST)技術(shù)對菌株的同源性進(jìn)行分析;通過質(zhì)粒的脈沖場凝膠電泳(S1-PFGE)和DNA印記染色(Southern blot)確定mcr-1基因是否位于質(zhì)粒及所在質(zhì)粒大小,通過基于PCR的質(zhì)粒不相容性分組(PBRT)實(shí)驗(yàn)確定攜帶mcr-1的質(zhì)粒類型;通過全基因組測序分析(WGS)獲得目的菌株的耐藥基因型、毒力基因以及mcr-1的基因環(huán)境。結(jié)果1.共分離出89株產(chǎn)ESBL大腸埃希菌,其中17株攜帶mcr-1基因,陽性率為19.1%。除土壤外,其他環(huán)境介質(zhì)如豬糞便、廢水、飲用水、河水、河流沉積物、蔬菜、排污口沉積物中均有mcr-1陽性菌株的檢出。大部分?jǐn)y帶mcr-1的大腸埃希菌對粘菌素、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢噻肟、四環(huán)素和氟苯尼考耐藥,對美羅培南和替加環(huán)素敏感;所有菌株均為多重耐藥菌,且攜帶多種耐藥基因。2.MLST結(jié)果顯示17株菌株分屬12個(gè)ST型,除本次研究新檢出的兩個(gè)型別外,所有ST型的菌株均有在人類、動物、環(huán)境中檢出的報(bào)道。PFGE結(jié)果顯示有兩對菌株同源性80%,分別為EF6(檢出自C村,ST10)與EF7(檢出自D村,ST206)具有較高的同源性,EF8(檢出自I村,ST542)與ES10(檢出自B村,ST906)具有較高的同源性,其中EF6、EF7和EF8分離自豬糞便,ES10分離自河流沉積物。3.S1-PFGE和Southernblot結(jié)果證實(shí)了大部分菌株攜帶的mcr-1基因?yàn)橘|(zhì)粒介導(dǎo),質(zhì)粒大小范圍在33～240kb之間,質(zhì)粒不相容性分組以IncHI2、IncI2、IncX4等類型為主。質(zhì)粒介導(dǎo)的mcr-1基因均可通過接合轉(zhuǎn)移到受體菌E.coli J53中,并使受體菌對粘菌素的耐藥程度增加甚至超過折點(diǎn)值。4.全基因組測序的結(jié)果顯示,mcr-1基因的下游均具有一個(gè)編碼PAP2家族蛋白的開放閱讀框,部分菌株的mcr-1上游和/或下游還具有與轉(zhuǎn)座子形成有關(guān)的ISAPI1結(jié)構(gòu)。除攜帶多種抗性基因外,部分菌株還同時(shí)攜帶與腸聚集性大腸桿菌(EAEC)和腸致病性大腸桿菌(EPEC)有關(guān)的毒力因子。結(jié)論1.攜帶粘菌素抗性基因mcr-1的產(chǎn)ESBL大腸埃希菌在家庭式養(yǎng)殖地區(qū)中廣泛檢出,且分布在不同的地理位置的不同環(huán)境介質(zhì)中,包括人們直接接觸的飲用水和即食蔬菜表面。除人為因素(如畜牧業(yè)養(yǎng)殖)外,干旱等自然現(xiàn)象也可能對mcr-1傳播的產(chǎn)生影響。2.大部分的攜帶mcr-1大腸埃希菌除了含有多種抗生素耐藥基因外,還可能同時(shí)攜帶對人類發(fā)病具有重要影響的毒力因子,突出了這些菌株具有遺傳可塑性以及環(huán)境介質(zhì)作為抗生素抗性和潛在致病菌出現(xiàn)的熱點(diǎn)所帶來的風(fēng)險(xiǎn)。3.家庭養(yǎng)殖地區(qū)多環(huán)境介質(zhì)中的攜帶mcr-1大腸埃希菌具有高度的特異性,mcr-1基因主要由質(zhì)粒介導(dǎo);含有mcr-1的質(zhì)粒在不相容性分組的類型、mcr-1的遺傳環(huán)境等方面同樣具有高度多樣性。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.61
【圖文】：

邐山東大學(xué)碩士學(xué)位論文邐逡逑機(jī)制尚未完全清晰，目前學(xué)界普遍接受的觀點(diǎn)是在液體環(huán)境下，多粘菌素殘基上逡逑的氨基發(fā)生質(zhì)子化反應(yīng)并與細(xì)菌外膜上的類脂Ａ磷酸基上的陰離子產(chǎn)生靜電吸逡逑引作用，隨后質(zhì)子化的多粘菌素取代二價(jià)氧離子（Ｍｇ２＋和Ｃａ２＋）來穩(wěn)定脂多糖層，逡逑同時(shí)多粘菌素的Ｎ－脂肪�；満停�、７位疏水部分插入到外膜層，使相鄰的脂質(zhì)逡逑Ａ的磷酸�；溔趸�，導(dǎo)致外膜膨脹然后通過“自促攝取”機(jī)制穿過細(xì)菌逡逑外膜，從而使細(xì)菌膜磷脂雙分子層的物理完整性被破壞，細(xì)胞內(nèi)的核苷酸、氨基逡逑酸、磷酸鹽等內(nèi)容物流出，抑制細(xì)胞的生長或?qū)е聺B透失衡和細(xì)菌死亡，具體機(jī)逡逑制見圖２［３２］。逡逑

通過將磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜脂多糖上的類脂Ａ部分并結(jié)合修飾，減少類脂逡逑Ａ淲酸基團(tuán)的負(fù)電荷，使磷酸基團(tuán)與多黏菌素結(jié)合能力變?nèi)�，從而�?dǎo)致細(xì)菌對粘逡逑菌素不敏感甚至耐藥，具體機(jī)制見圖３［３６］。逡逑——多壚素一￣￣邐產(chǎn)逡逑／邐康多糖逡逑，Ａ邐；邋Ｉ邐一邐硌酸？？．辨胺轉(zhuǎn)移酶－逡逑￥邋二：邋ｍ逡逑＾■＾Ｌｔ邐ｉｉＪｕｙｉａＴＬ邋邐—閣■努邐＾４，邐ＪＬｒｆｇｉｉａｉｎｘＱ逡逑＇邐邋－——岕白—￣逡逑＇邋．，／：：邋￣１＇：；邋＾｜卜逡逑圖３．邋ｚｎｃｒ－／導(dǎo)致細(xì)菌對粘菌素產(chǎn)生耐藥的機(jī)制逡逑現(xiàn)有研究表明，ｗｃｒ－７基因通過質(zhì)粒作為載體存在于自然界微生物中，通過逡逑水平基因轉(zhuǎn)移進(jìn)行質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移和基因的交換。這種轉(zhuǎn)移模式不同于傳統(tǒng)遺傳物質(zhì)逡逑由親代到子代的轉(zhuǎn)移，傳播速度更快［３７］。攜帶／ｗｒ－７的質(zhì)粒同時(shí)呈現(xiàn)出多樣性，逡逑不相容組分型包括ＩｎｃＨＩ２、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＸ４、ＩｎｃＦＩＩ、ＩｎｃＦ等，質(zhì)粒大小不一，逡逑分子量范圍在３０￣３００ｋｂ之間，其中ＩｎｃＩ２、丨ｎｃＸ４和丨ｎｃＨ１２型最為常見［３８］。質(zhì)粒逡逑之間的同源性差距較大

邐山東大學(xué)碩士學(xué)位論文邐逡逑檢測ｍｃｒ－／基因需要用到的ＰＣＲ引物見表３。逡逑表３．／ＷＣＴ－／基因引物逡逑目標(biāo)基因邐ｉｌｌｉ邐序列（５，－３，）邐產(chǎn)物大�。ǎ猓穑䥇⒖嘉墨I(xiàn)逡逑ｍｃｒ－Ｉ－Ｆ邋ＣＧＧＴＣＡＧＴＣＣＧＴＴＴＧＴＴＣ逡逑而－丨邐ｍｃｒ－ｌ－Ｒ邋ＣＴＴＧＧＴＣＧＧＴＣＴＧＴＡＧＧＧ邐３０９邐［］逡逑注：Ｆ為上游引物，Ｒ為下游引物逡逑２．邋２具體試驗(yàn)方法逡逑２．邋２．邋１采樣點(diǎn)的確定逡逑

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7 蔣沁p

本文編號：2792050