【摘要】：禽圓環(huán)病毒2型(AGV2)是在2011被報道發(fā)現(xiàn)的指環(huán)病毒屬的第二個成員,于2015年首次在我國被檢測報道。AGV2不僅僅感染禽類,而且還有若干關于AGV2在健康人類、器官移植病人和艾滋病病毒(HIV)陽性病人血液中的檢測報道。而對于該病毒的其他方面我們卻知之甚少。AGV2在全球范圍內(nèi)的傳播和感染,使其對養(yǎng)禽業(yè)和公共衛(wèi)生安全都表現(xiàn)出了巨大的潛在威脅。本研究組在2015年4月到2016年4月間,進行了覆蓋中國大部分地區(qū)養(yǎng)禽業(yè)中AGV2的流行病學調(diào)查。在來自15個不同的省(市)的總計448份禽類病料(2015年282份,2016年166份)中,共檢測到了 55個陽性結(jié)果,其中2015年有45個,2016年有10個,總陽性率為12.28%,這些陽性結(jié)果分布在11個省(市)中。在陽性結(jié)果中,只有10個(18.19%)是單獨感染,其余的(81.82%)都為混合感染。對AGV2陽性結(jié)果的地理和時間分布的分析顯示,85.45%的陽性病料收集自我國的北方,并且在秋天獲得了更多的陽性病料。此外,我們檢測了我國北方在售的商用禽類疫苗中AGV2基因組的混入情況。結(jié)果顯示,來自11個不同生產(chǎn)商的23個疫苗為AGV2陽性,陽性比例為27.71%,而在所有23個陽性結(jié)果中,有17個疫苗(73.91%)為NDV和IBV相關疫苗。部分序列的測序結(jié)果顯示,多株AGV2毒株混入在疫苗中。本研究的結(jié)果對疫苗的安全性提出了挑戰(zhàn),同時也提高了 AGV2的威脅性。利用三段部分重疊的PCR測序結(jié)果進行AGV2全基因組序列的拼接,然后參考GenBank中的所有已知核酸序列分析了不同宿主來源AGV2的遺傳進化關系,又進一步分析了不同進化分枝中病毒蛋白的特點,比較了中國毒株和國外毒株病毒蛋白的變化趨勢。實驗中,從2015年至2016年國內(nèi)不同地區(qū)的病料中一共獲得了 17株禽源AGV2全基因組序列,經(jīng)序列分析比對,所有不同宿主來源的AGV2被分成了 A-D四個組;在VP1的第288-314位氨基酸發(fā)現(xiàn)疑似高變區(qū);找到了 VP2與VP3不同分組的氨基酸變化規(guī)律;在AGV2的5'-UTR發(fā)現(xiàn)了3個重復序列的新基序,并對DR區(qū)進行了分類和統(tǒng)計分析。根據(jù)AGV2的保守序列建立了對于AGV2有高靈敏性的熒光定量PCR檢測方法。此方法的靈敏度為100個病毒基因組拷貝,是常規(guī)PCR靈敏度的10倍;此方法重復性良好,組內(nèi)和組間檢測的變異系數(shù)都小于1%。利用其高靈敏性,從臨床病料中檢測到了更多的陽性結(jié)果,其中15/82(17.24%)個雞源和8/29(27.58%)人源AGV2陽性結(jié)果,與常規(guī)PCR的結(jié)果(12.20%和18.29%)有顯著的差異(P0.01)。應用此定量方法,我們研究了 AGV2在臨床感染雞只中不同器官和組織的病毒載量。結(jié)果顯示,AGV2在雞體內(nèi)有廣泛的分布;在肺臟和血液中有很高的病毒載量。通過1日齡SPF雞的體內(nèi)實驗,對AGV2進行了病毒分離,并通過PCR與負染色電鏡對AGV2進行了鑒定。而后,初步探索了 AGV2的致病性。選取垂直傳播感染非致病性CAV的1日齡雛雞,通過肌肉注射感染AGV2HLJ1508毒株。結(jié)果顯示,混合感染造成了 56.67%的致死率,并伴隨嚴重的出血-再生障礙性貧血癥。混合感染引起了顯著的肝脾腫大,胸腺萎縮,明顯的腺胃出血和骨髓黃化。除此之外,血常規(guī)檢測也證明了混合感染造成的貧血癥和免疫抑制。對AGV2的基因功能進行了研究,包括5'-UTR與病毒蛋白兩部分。其一,找到了 AGV2的啟動子序列,并通過一系列雙熒光報告系統(tǒng)證明了其起始轉(zhuǎn)錄的功能,此外,證明了 5'-UTR中DR區(qū)有著增強子的功能。更有趣的是,在蛋白水平和核酸水平證實了不同DR組合的轉(zhuǎn)錄能力存在著差異,這可能是影響AGV2分離株致病性的原因之一。其二,探索了 AGV2 VP2和VP3在癌癥細胞中的功能。首先,這兩個病毒蛋白有著相似的亞細胞定位,都定位于Hela細胞的細胞核中。通過流式細胞術檢測到這兩種病毒蛋白可以誘導約50%的Hela細胞發(fā)生凋亡,但它們引起線粒體釋放細胞色素C的能力卻不同,提示此兩種蛋白誘導凋亡的通路可能不同。此外,這兩種蛋白都可以上調(diào)DNA損傷標志分子γH2AX的表達量,而同時上調(diào)表達的Chk2暗示此兩種蛋白可能涉及ATM-Chk2細胞周期信號通路。在本研究中獲得的結(jié)果建立了對AGV2分子生物學特性和基因功能的初步認識,為進一步揭開AGV2和指環(huán)病毒生物學特性的神秘面紗提供了豐富的研究材料。
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65
【圖文】：

２．７禽圓環(huán)病毒２型５ＭＪＴＲ的功能研究逡逑２．７．１雙焚光報告基因的構(gòu)建方案逡逑根據(jù)ＡＧＶ２基因組的結(jié)構(gòu)模式圖，圖２－１，為研究ＡＧＶ２的５＇－ＵＴＲ以及ＤＲ區(qū)的功逡逑能，設計了如下的實驗方案。在ＡＧＶ２的編碼區(qū)上游，－３３邋ｂｐ位置有一個ＴＡＴＡ邋ｂｏｘ，逡逑（丁人丁人八０），而且在－９５邋６？位置存在一個匚八人丁１３（？，（０：入八�。Ｍ茰y人０￥２的５，－１；�。保睉义显摼哂袉幼拥墓δ埽蕵�(gòu)建雙熒光報告系統(tǒng)驗證此功能。逡逑－９５邋ｂｐ邐ＣＡＡＴｂｏｘ邋（ＣＣＡＡＴ）逡逑－３３邋ｂｐ邐ＴＡＴＡ邋ｂｏｘ邋（ＴＡＴＡＡＧ）逡逑圖２－１邋ＡＧＶ２基因組的結(jié)構(gòu)模式圖逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｔｈｅ邋ｍｏｄｅｌ邋ｐａｔｔｅｒｎ邋ｏｆ邋ＡＧＶ２邋ｇｅｎｏｍｅ逡逑首先，為控制變量，通過序列比對，找到不同ＡＧＶ２５＇－ＵＴＲ中的同源性最高的啟動子序逡逑列，并作為雙熒光報告質(zhì)粒的公共部分。逡逑然后，根據(jù)３．３．３．５獲得的不同ＡＧＶ２邋ＤＲ區(qū)的組合特點，除Ａ－Ｆ六種被發(fā)現(xiàn)的組合形逡逑式，又人為創(chuàng)造了一個只在第二個元件出現(xiàn)ｂ型ＤＲ的新

２．７禽圓環(huán)病毒２型５ＭＪＴＲ的功能研究逡逑２．７．１雙焚光報告基因的構(gòu)建方案逡逑根據(jù)ＡＧＶ２基因組的結(jié)構(gòu)模式圖，圖２－１，為研究ＡＧＶ２的５＇－ＵＴＲ以及ＤＲ區(qū)的功逡逑能，設計了如下的實驗方案。在ＡＧＶ２的編碼區(qū)上游，－３３邋ｂｐ位置有一個ＴＡＴＡ邋ｂｏｘ，逡逑（丁人丁人八０），而且在－９５邋６？位置存在一個匚八人�。保常ǎ�，（０：入八丁）。推測人０￥２的５，－１；丁１１應逡逑該具有啟動子的功能，故構(gòu)建雙熒光報告系統(tǒng)驗證此功能。逡逑－９５邋ｂｐ邐ＣＡＡＴｂｏｘ邋（ＣＣＡＡＴ）逡逑－３３邋ｂｐ邐ＴＡＴＡ邋ｂｏｘ邋（ＴＡＴＡＡＧ）逡逑圖２－１邋ＡＧＶ２基因組的結(jié)構(gòu)模式圖逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｔｈｅ邋ｍｏｄｅｌ邋ｐａｔｔｅｒｎ邋ｏｆ邋ＡＧＶ２邋ｇｅｎｏｍｅ逡逑首先，為控制變量，通過序列比對，找到不同ＡＧＶ２５＇－ＵＴＲ中的同源性最高的啟動子序逡逑列，并作為雙熒光報告質(zhì)粒的公共部分。逡逑然后，根據(jù)３．３．３．５獲得的不同ＡＧＶ２邋ＤＲ區(qū)的組合特點，除Ａ－Ｆ六種被發(fā)現(xiàn)的組合形逡逑式，又人為創(chuàng)造了一個只在第二個元件出現(xiàn)ｂ型ＤＲ的新

根據(jù)示意圖２－３的方案，以ｐＣＡＧＧＳ哺乳動物細胞真核表達載體為骨架，分別構(gòu)逡逑建名為邋Ｇ＋Ｒ，ＧＰＲ邋和邋Ａ－ＤＲ、Ｂ－ＤＲ、Ｃ－ＤＲ、Ｄ－ＤＲ、Ｅ－ＤＲ、Ｆ－ＤＲ邋與邋Ｍ－ＤＲ邋共邋９邋個雙熒光報逡逑告質(zhì)粒。逡逑Ａ－ＤＲ逡逑Ｂ－ＤＲ邐｜逡逑Ｃ－ＤＲ邐｜＿邐邋＾邐＿＿＿＿＿＿逡逑Ｄ－ＤＲ邋一邋ＧＦｐ邋＿一邋．ｉｌＸＤＳＡ＾Ｄｉｉ：邋．１１】遍ｉｉ媝＾１：卿】逡逑Ｅ－ＤＲ邐Ｆ逡逑Ｆ－ＤＲ逡逑Ｍ－ＤＲ」邐｜逡逑ＧＰＲ邐ＧＦＰ邐？邋卿？逡逑Ｇ＋Ｒ邐＾邋ＪＳＦＰ邋二逡逑圖２－３構(gòu)建的雙熒光報告基因示意圖逡逑Ｆｉｇ．２－３邋Ｔｈｅ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｄｕａｌ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｒｅｐｏｒｔｅｒ邋ｇｅｎｅ邋ｓｙｓｔｅｍ逡逑其中，Ｇ＋Ｒ指的是在ＧＦＰ完整ＯＲＦ的終止密碼子（ＴＡＡ）后，緊接著加上ＲＦＰ的完整逡逑讀碼框所構(gòu)成的報告質(zhì)粒；ＧＰＲ指的是在質(zhì)粒Ｇ＋Ｒ的基礎上，在ＧＦＰ的終止密碼子之后，逡逑在ＲＦＰ的讀碼框之前，插入公共的啟動子序列所構(gòu)成的報告質(zhì)粒；Ａ－ＤＲ、Ｂ－ＤＲ等指的是在逡逑質(zhì)粒ＧＰＲ的基礎上，在啟動子序列之前，在ＧＦＰ的終止密碼子之后，插入Ａ型或Ｂ型等的逡逑ＤＲ組合所構(gòu)成的報告質(zhì)粒。逡逑２．７．２融合ＰＣＲ構(gòu)建重組質(zhì)粒逡逑首先，分別用引物ｅＧＦＰ－Ｆ、ｅＧＦＰ－Ｒ和引物ｍＲＦＰ－Ｆ、ｍＲＦＰ－Ｒ從質(zhì)粒ｐＥＧＦＰ－Ｎｌ和逡逑ｐｌｔＬＣ３上擴增出完整的ｅＧＦＰ與ｍＲＦＰ的讀碼框。再用引物Ｅｘｔｅｎｄｅｄ－ｅＧＦＰ－Ｆ、ｅＧＦＰ－Ｒ和逡逑ｍＲＦＰ－Ｆ、Ｅｘｔｅｎｄｅｄ－ｍＲＦＰ－Ｒ，以ｅＧＦＰ和ｍＲＦＰ為模板，分別擴增出帶有同源臂的ｅＧＦＰ和逡逑ｍＲＦＰ

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 陸桂麗;高玉龍;高宏雷;冉多良;王曉燕;王笑梅;;雞傳染性貧血病毒VP2蛋白單克隆抗體的制備與鑒定[J];中國獸醫(yī)科學;2007年05期

本文編號：2776273