【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種以妊娠母豬繁殖障礙、哺乳仔豬的呼吸道疾病和高死亡率為特征的一種病毒性傳染病。PRRSV感染引起機體的免疫抑制,從而形成持續(xù)感染。研究表明,PRRSV的許多非結構蛋白在拮抗宿細胞先天性免疫與調(diào)控病毒復制方面起著重要作用,為了探究PRRSVNSP12的功能,本研究從蛋白相互作用的角度探究NSP12在病毒感染中的作用,本試驗以HP-PRRSVHuN4毒株NSP12為研究對象,構建PGBKT7-NSP12誘餌質(zhì)粒,通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與NSP12相互作用的宿主細胞蛋白,并且對篩選結果進行驗證與分析。為了建立NSP12的研究基礎,首先利用原核表達系統(tǒng)成功表達NSP12,得到特異性較好的NSP12的鼠源多克隆抗體;經(jīng)Western-blot和間接免疫熒光鑒定,證明本研究所制備的多克隆抗體能夠特異性識別PRRSV病毒NSP12及真核表達的NSP12蛋白,為后續(xù)試驗提供輔助材料。隨后,構建酵母誘餌質(zhì)粒pGBKT7-NSP12,驗證無毒性與自激活現(xiàn)象后,通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選PAMcDNA文庫中與NSP12相互作用的宿主細胞蛋白;經(jīng)篩選與回復雜交試驗驗證,結果顯示:共篩選到8種能夠與NSP12相互作用的宿主細胞蛋白,根據(jù)BLAST序列比對與GO分析,篩選到的蛋白主要為一些伴侶蛋白如FTH1、ZNF598和介導細胞凋亡過程的相關蛋白 LGALS3、UCP2 等。為了對酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到的陽性結果進行驗證,本試驗研究進一步利用免疫共沉淀和激光共聚焦等試驗驗驗證了 CD63、LGALS3兩種蛋白與NSP12的相互作用。結果表明:NSP12能將LGALS3沉淀下來,且明顯的共定位于胞漿;NSP12與CD63蛋白也有共定位現(xiàn)象,說明NSP12與這兩種蛋白的確存在相互作用。單獨體外過表達LGALS3后感染PRRSVHuN4病毒,不同時間收取細胞上清,測定病毒TCID50,與對照組相比結果表明:LGALS3對PRRSV增殖有抑制作用。上述研究結果為深入解析PRRSV病毒感染機制提供了新的理論依據(jù)。
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65
【圖文】：

殖與呼吸綜合征病毒ＮＳＰ１２與宿主細胞相互作用蛋白的篩選期也隨之變短；病毒的熱穩(wěn)定性差，在低溫條件下活２０ｍｉｎＤ８］，４５ｍｉｎ則會完全失去致病性。病毒對Ｐ洗漆劑中不Ｂ纟穩(wěn)定生存。逡逑染的主要靶細胞是豬肺泡巨噬細胞（ＰＡＭ），完全分化染的最初細胞目標。另外也有報道發(fā)現(xiàn)樹突狀細染試驗表明，ＰＲＲＳＶ也可在傳代非洲綠猴腎細胞（顯的細胞病變（0＞＾（職如０邋６￡『６（＾，匚？￡），可見細胞聚ＰＲＲＳＶ在ＰＡＭ細胞上生長較好，在其它種類細胞在以上細胞均能夠良好增殖。逡逑

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圖２尼多病毒目分類逡逑Ｆｉｇ．２邋Ｔａｘｏｎｏｍｙ邋ｏｆ邋Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ邋ｏｒｄｅｒ逡逑１．３．２邋ＰＲＲＳＶ基因結構與其編碼的結構蛋白逡逑ＰＲＲＳＶ基因組全長約１５ｋｂ，在５’端有帽子結構，３’端含有ｐｏｌｙ（Ａ）序列，ＰＲＲＳＶ逡逑的基因組ＲＮＡ是正鏈、３’端聚腺苷酸化的分子。在５’端和３’端分別含有一段非編逡逑碼區(qū)（Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ邋ｒｅｇｉｏｎ，邋ＵＴＲ邋），含有至少邋１０邋個開放閱讀框（Ｏｐｅｎ邋ｒｅａｄｉｎｇ逡逑ｆｒａｍｅｓ，ＯＲＦ），包括邋ＯＲＦｌａ、ＯＲＦｌｂ、ＯＲＦ２ａ、ＯＲＦ２ｂ、ＯＲＦｓ３－７、ＯＲＦ５ａＢ３－２６】。其中，逡逑病毒的復制酶基因包括大開放性閱讀框ＯＲＦｌａ和ＯＲＦｌｂ，位于基因組５’端，約占逡逑基因組全長的四分之三（圖２）。比起保守性更高的ＯＲＦｌｂ，邋ＯＲＦｌａ的大小常常不逡逑同，因為該基因的非結構蛋白２邋（ｎｓｐ２）具有很高的變異性。ＯＲＦｌａ和ＯＲＦｌｂ編碼逡逑兩個非常大的非結構聚合蛋白，多聚蛋ｔｌｐｐｌａ、ｐｐｌａｂ；而這些多聚蛋白可進一步逡逑水解切割形成成邋ＮＳＰｌｃｔ，ＮＳＰ１（３，邋ＮＳＰ２－ＮＳＰ６，ＮＳＰ７ａ，ＮＳＰ７ｐ，邋ＮＳＰ８－ＮＳＰ１２邋等逡逑—系列非結構蛋０（Ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，邋ｎｓｐ）［２７－３＇］（圖邋３）。逡逑Ｅｘｒｅｓｓｅｄ邋ｆｒｏｍｅｎｏｍｉｃ邋ＲＮＡ邐Ｅｘｒｅｓｓｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ｓｕｂｅｎｏｍｉｃ邋ｍＲＮｓ逡逑

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

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相關碩士學位論文 前1條

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本文編號：2775472