發(fā)布時間：2020-07-30 11:23

【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種以妊娠母豬繁殖障礙、哺乳仔豬的呼吸道疾病和高死亡率為特征的一種病毒性傳染病。PRRSV感染引起機體的免疫抑制,從而形成持續(xù)感染。研究表明,PRRSV的許多非結(jié)構(gòu)蛋白在拮抗宿細(xì)胞先天性免疫與調(diào)控病毒復(fù)制方面起著重要作用,為了探究PRRSVNSP12的功能,本研究從蛋白相互作用的角度探究NSP12在病毒感染中的作用,本試驗以HP-PRRSVHuN4毒株NSP12為研究對象,構(gòu)建PGBKT7-NSP12誘餌質(zhì)粒,通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與NSP12相互作用的宿主細(xì)胞蛋白,并且對篩選結(jié)果進(jìn)行驗證與分析。為了建立NSP12的研究基礎(chǔ),首先利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)NSP12,得到特異性較好的NSP12的鼠源多克隆抗體;經(jīng)Western-blot和間接免疫熒光鑒定,證明本研究所制備的多克隆抗體能夠特異性識別PRRSV病毒NSP12及真核表達(dá)的NSP12蛋白,為后續(xù)試驗提供輔助材料。隨后,構(gòu)建酵母誘餌質(zhì)粒pGBKT7-NSP12,驗證無毒性與自激活現(xiàn)象后,通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選PAMcDNA文庫中與NSP12相互作用的宿主細(xì)胞蛋白;經(jīng)篩選與回復(fù)雜交試驗驗證,結(jié)果顯示:共篩選到8種能夠與NSP12相互作用的宿主細(xì)胞蛋白,根據(jù)BLAST序列比對與GO分析,篩選到的蛋白主要為一些伴侶蛋白如FTH1、ZNF598和介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程的相關(guān)蛋白 LGALS3、UCP2 等。為了對酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到的陽性結(jié)果進(jìn)行驗證,本試驗研究進(jìn)一步利用免疫共沉淀和激光共聚焦等試驗驗驗證了 CD63、LGALS3兩種蛋白與NSP12的相互作用。結(jié)果表明:NSP12能將LGALS3沉淀下來,且明顯的共定位于胞漿;NSP12與CD63蛋白也有共定位現(xiàn)象,說明NSP12與這兩種蛋白的確存在相互作用。單獨體外過表達(dá)LGALS3后感染PRRSVHuN4病毒,不同時間收取細(xì)胞上清,測定病毒TCID50,與對照組相比結(jié)果表明:LGALS3對PRRSV增殖有抑制作用。上述研究結(jié)果為深入解析PRRSV病毒感染機制提供了新的理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65
【圖文】：

殖與呼吸綜合征病毒ＮＳＰ１２與宿主細(xì)胞相互作用蛋白的篩選期也隨之變短；病毒的熱穩(wěn)定性差，在低溫條件下活２０ｍｉｎＤ８］，４５ｍｉｎ則會完全失去致病性。病毒對Ｐ洗漆劑中不Ｂ纟穩(wěn)定生存。逡逑染的主要靶細(xì)胞是豬肺泡巨噬細(xì)胞（ＰＡＭ），完全分化染的最初細(xì)胞目標(biāo)。另外也有報道發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)染試驗表明，ＰＲＲＳＶ也可在傳代非洲綠猴腎細(xì)胞（顯的細(xì)胞病變（0＞＾（職如０邋６￡『６（＾，匚？￡），可見細(xì)胞聚ＰＲＲＳＶ在ＰＡＭ細(xì)胞上生長較好，在其它種類細(xì)胞在以上細(xì)胞均能夠良好增殖。逡逑

圖２尼多病毒目分類逡逑Ｆｉｇ．２邋Ｔａｘｏｎｏｍｙ邋ｏｆ邋Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ邋ｏｒｄｅｒ逡逑

圖２尼多病毒目分類逡逑Ｆｉｇ．２邋Ｔａｘｏｎｏｍｙ邋ｏｆ邋Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ邋ｏｒｄｅｒ逡逑１．３．２邋ＰＲＲＳＶ基因結(jié)構(gòu)與其編碼的結(jié)構(gòu)蛋白逡逑ＰＲＲＳＶ基因組全長約１５ｋｂ，在５’端有帽子結(jié)構(gòu)，３’端含有ｐｏｌｙ（Ａ）序列，ＰＲＲＳＶ逡逑的基因組ＲＮＡ是正鏈、３’端聚腺苷酸化的分子。在５’端和３’端分別含有一段非編逡逑碼區(qū)（Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ邋ｒｅｇｉｏｎ，邋ＵＴＲ邋），含有至少邋１０邋個開放閱讀框（Ｏｐｅｎ邋ｒｅａｄｉｎｇ逡逑ｆｒａｍｅｓ，ＯＲＦ），包括邋ＯＲＦｌａ、ＯＲＦｌｂ、ＯＲＦ２ａ、ＯＲＦ２ｂ、ＯＲＦｓ３－７、ＯＲＦ５ａＢ３－２６】。其中，逡逑病毒的復(fù)制酶基因包括大開放性閱讀框ＯＲＦｌａ和ＯＲＦｌｂ，位于基因組５’端，約占逡逑基因組全長的四分之三（圖２）。比起保守性更高的ＯＲＦｌｂ，邋ＯＲＦｌａ的大小常常不逡逑同，因為該基因的非結(jié)構(gòu)蛋白２邋（ｎｓｐ２）具有很高的變異性。ＯＲＦｌａ和ＯＲＦｌｂ編碼逡逑兩個非常大的非結(jié)構(gòu)聚合蛋白，多聚蛋ｔｌｐｐｌａ、ｐｐｌａｂ；而這些多聚蛋白可進(jìn)一步逡逑水解切割形成成邋ＮＳＰｌｃｔ，ＮＳＰ１（３，邋ＮＳＰ２－ＮＳＰ６，ＮＳＰ７ａ，ＮＳＰ７ｐ，邋ＮＳＰ８－ＮＳＰ１２邋等逡逑—系列非結(jié)構(gòu)蛋０（Ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，邋ｎｓｐ）［２７－３＇］（圖邋３）。逡逑Ｅｘｒｅｓｓｅｄ邋ｆｒｏｍｅｎｏｍｉｃ邋ＲＮＡ邐Ｅｘｒｅｓｓｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ｓｕｂｅｎｏｍｉｃ邋ｍＲＮｓ逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 楊漢春,黃芳芳,郭鑫,高云,李華,陳聲;豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)BJ-4株全基因組序列測定與分析[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報;2001年03期

2 仇華吉,郭寶清,童光志,劉文興,于力;豬繁殖 - 呼吸道綜合征病毒(PRRSV)CH-1a株基因型鑒定[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;1998年02期

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相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 王鑫;豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染對Ⅰ型干擾素表達(dá)影響的分析[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

本文編號：2775472