發(fā)布時間：2020-07-29 21:34

【摘要】：運(yùn)輸應(yīng)激嚴(yán)重影響著畜禽的健康,給畜牧業(yè)帶來極大的損失。本研究運(yùn)用搖床(60rpm,35℃、2h/d)禁食禁水條件下分別刺激大鼠1天、2天、3天,來模擬夏季運(yùn)輸應(yīng)激,闡明運(yùn)輸應(yīng)激大鼠心肌損傷的機(jī)制,探討中藥抗運(yùn)輸應(yīng)激的作用機(jī)制,利用應(yīng)激反應(yīng)的研究成果來防病治病,盡量減少和避免運(yùn)輸應(yīng)激對畜牧生產(chǎn)帶來的嚴(yán)重危害。通過大鼠臨床表現(xiàn)、激素水平、生理生化等指標(biāo)評價(jià)應(yīng)激模型。利用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察模擬運(yùn)輸應(yīng)激大鼠心肌組織顯微及超微結(jié)構(gòu)變化,TUNEL染色檢測應(yīng)激大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況。從基因水平和蛋白水平探討模擬運(yùn)輸應(yīng)激導(dǎo)致大鼠心肌細(xì)胞凋亡的信號機(jī)制,并研究酸棗仁湯對模擬運(yùn)輸應(yīng)激大鼠心肌損傷的作用機(jī)制。體外運(yùn)用去甲腎上腺素(NE)刺激大鼠心肌細(xì)胞(H9C2)建立細(xì)胞應(yīng)激模型,通過對H9C2細(xì)胞形態(tài)觀察,MTT法檢測細(xì)胞活力,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況等手段來評價(jià)細(xì)胞應(yīng)激模型。利用基因芯片(差異基因聚類分析、GO分析、Pathway分析)及microRNA深度測序技術(shù)探討NE誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制,篩選關(guān)鍵microRNA和信號蛋白,并從基因水平和蛋白水平研究酸棗仁皂苷A對關(guān)鍵microRNA及主要信號通路的調(diào)控作用。主要得出以下結(jié)果： 1.搖床(60rpm、35℃、2h/d)在禁食禁水條件下分別刺激大鼠1天、2天、3天,可見大鼠體重下降、體溫升高,血糖、血清皮質(zhì)酮、血漿。腎上腺素和去甲腎上腺素等激素水平均顯著升高,不同應(yīng)激天數(shù)大鼠心肌組織HSP27/70/90mRNA水平也都顯著升高：應(yīng)激3天組的CK、LDH、CTnT及BNP也明顯升高,說明模擬運(yùn)輸處理導(dǎo)致大鼠發(fā)生了明顯的應(yīng)激反應(yīng),并且模擬應(yīng)激3天導(dǎo)致大鼠心肌損傷。 2.本研究發(fā)現(xiàn)模擬運(yùn)輸應(yīng)激通過磷酸化凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK-1)、p38、c-jun氨基端蛋白激酶(JNK)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)和AKT蛋白等激活大鼠心肌組織MAPK和AKT信號通路,然而連續(xù)的強(qiáng)烈應(yīng)激導(dǎo)致促凋亡信號通路(JNK和p38)及抗凋亡信號通路(ERK和AKT)失衡,并進(jìn)一步激活線粒體凋亡通路,導(dǎo)致大鼠心肌細(xì)胞凋亡。 3.酸棗仁湯能夠明顯降低模擬運(yùn)輸應(yīng)激大鼠血清中NE、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)及心肌鈣蛋白T (CTnT)的含量,降低Bax/Bcl-2比值抑制心肌細(xì)胞凋亡,降低心肌損傷。 4.NE通過升高microRNA-325-5p. Bax/Bcl-2比值以及啟動JNK、P38信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。JUA可以通過降低Bax/Bcl-2比值,抑制NE誘導(dǎo)的JNK、P38及線粒體凋亡信號通路的激活,促進(jìn)ERK和AKT信號通路來發(fā)揮抗凋亡作用。 結(jié)論：本研究60rpm35℃搖床禁食禁水條件模擬夏天公路運(yùn)輸,引起大鼠強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng),并通過MAPK信號通路及線粒體通路誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞凋亡,酸棗仁湯能夠降低模擬運(yùn)輸應(yīng)激導(dǎo)致的大鼠心肌損傷。體外應(yīng)激激素NE刺激H9C2細(xì)胞凋亡驗(yàn)證了體內(nèi)的應(yīng)激機(jī)制,并且發(fā)現(xiàn)-nicroRNA-325-5P能夠促進(jìn)NE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡,JUA可以通過降低Bax/Bcl-2比值,抑制NE誘導(dǎo)的JNK、P38及線粒體凋亡信號通路的激活,促進(jìn)ERK和AKT信號通路發(fā)揮抗凋亡作用。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.3
【圖文】：

為了檢測模擬運(yùn)輸應(yīng)激后心肌損傷的程度，我們分別用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡對應(yīng)激前后大鼠心臟結(jié)構(gòu)進(jìn)行了形態(tài)學(xué)的觀察。如圖3-1所示，用HE對大鼠心肌組織染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察到對照組大鼠心肌組織肌束排列規(guī)則、清晰；而應(yīng)激1天組（Sid)大鼠的心肌組織有輕微充血和出血，應(yīng)激2天組（S2d)和3天（S3d)組大鼠心肌組織充血、出血現(xiàn)象更加明顯，并伴有細(xì)胞核不規(guī)則堆積，連續(xù)應(yīng)激過程中突然辭死的大鼠（SD),對其解剖同樣進(jìn)行HE染色觀察期心肌組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，隨處可見逸出的血紅蛋白，心肌組織肌束嚴(yán)重地紊亂。如圖3-2所示，電子顯微鏡下觀察到對照組和應(yīng)激1、2、3d組大鼠心肌組織肌小節(jié)輪廓明顯

Bcl-w基因PCR產(chǎn)物電泳圖

試驗(yàn)共挑取5個菌落，進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)完畢后取5^11^產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳分析，用載體上游和載體下游引物擴(kuò)增的條帶理論大小為900p左右，其實(shí)際擴(kuò)增條帶如圖6-3:69

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2774525