【摘要】：乳酸菌作為一種具有益生功能的革蘭氏陽性菌,能發(fā)酵碳水化合物。植物乳桿菌(Lb.plantarum)具有高黏附性及疏水性使其不但能在腸道定植,成為優(yōu)勢菌群,發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)活性,而且可以直接捕獲病毒,起抗病毒作用。作為一種益生菌,將其作為載體遞呈藥物或保護(hù)性抗原蛋白,具有廣泛應(yīng)用。通過錨定蛋白作為表面展示原件,使外源蛋白錨定表達(dá)在新功能型植物乳桿菌表面,提高了外源蛋白的局部濃度并減少其在消化道的水解。豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)是兩種腸道冠狀病毒,能引起仔豬腹瀉、脫水、嘔吐等癥狀,具有較高的死亡率。兩種病毒的共感染越發(fā)頻繁,因此,開發(fā)一種新藥用來預(yù)防和治療混合病毒感染的仔豬腹瀉尤為重要。Ⅲ型干擾素(IFN-λ)在上皮組織抗病毒初期起著重要的防御作用。IFN-λ通過Jak-STAT通路抑制病毒的感染和復(fù)制,上調(diào)通路下游的ISGs表達(dá),使鄰近健康細(xì)胞進(jìn)入抗病毒狀態(tài)。為了構(gòu)建錨定表達(dá)豬IFN-λ3植物乳桿菌,將干擾素的抗病毒活性與乳酸菌的益生特性結(jié)合,發(fā)揮新功能型乳酸菌的抗病毒功能,本研究分為四個部分:(1)首先對CWA蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,獲得錨定蛋白CWA,并構(gòu)建錨定表達(dá)新功能型植物乳桿菌Lb.plantarum-pSIP-409-0373-EGFP-CWA(Lb.plantarum-409EC)。通過流式細(xì)胞術(shù)、Western Blot、直接免疫熒光等方法檢測新功能型植物乳桿菌錨定EGFP的能力。測定最佳誘導(dǎo)條件和新功能型乳酸菌的生長速率等。(2)其次構(gòu)建重組大腸桿菌BL21-pET-30a-IFN-λ3,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后通過Western Blot驗證目的蛋白成功表達(dá)在包涵體內(nèi)。純化、復(fù)性IFN-λ3蛋白并驗證了其抗PEDV和TGEV的活性。(3)構(gòu)建新功能型植物乳桿菌Lb.plantarum-pSIP-409-0373-IFN-λ3-CWA(Lb.plantarum-409IC)、Lb.plantarum-pSIP-409-pgsA′-IFN-λ3(Lb.plantarum-409P′I)并通過流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot驗證IFN-λ3在菌株表面表達(dá)成功,證明了CWA錨定方式比pgsA′能更高效的錨定表達(dá)豬IFN-λ3。(4)將誘導(dǎo)后的新功能型乳酸菌和IPEC-J2細(xì)胞共培養(yǎng),并用PEDV和TGEV分別感染IPEC-J2細(xì)胞,通過實時熒光定量PCR(qPCR)證實,兩種新功能型乳酸菌Lb.plantarum-409IC、Lb.plantarum-409P′I在不同濃度和時間點均可顯著抑制PEDV、TGEV兩種病毒在IPEC-J2中的RNA轉(zhuǎn)錄水平(0.01p0.05),且新功能型乳酸菌Lb.plantarum-409IC抑制病毒復(fù)制作用更強。通過間接免疫熒光證明與對照組相比,新功能型乳酸菌處理組在IPEC-J2/PEDV系統(tǒng)和IPEC-J2/TGEV系統(tǒng)中病毒載量明顯降低。qPCR測定IPEC-J2細(xì)胞經(jīng)新功能型乳酸菌Lb.plantarum-409IC刺激后,干擾素刺激基因:干擾素刺激基因15(ISG15)、抗粘液病毒基因(Mx1)、和干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3(IFITM3)的相對表達(dá)量均明顯上調(diào)。表明該新功能型乳酸菌可以通過提高IPEC-J2抗病毒基因的相對表達(dá)量,起到一定抑制病毒復(fù)制的作用。本研究證明了CWA和pgsA′兩種蛋白都能將豬IFN-λ3錨定在植物乳桿菌表面,并發(fā)現(xiàn)新功能型乳酸菌Lb.plantarum-409IC抗PEDV和TGEV效果更強,本研究為新型乳酸菌制劑預(yù)防和治療豬PEDV、TGEV感染奠定了一定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S858.28
【圖文】：

顯微鏡 DMi8（德國徠卡公司）；流式細(xì)胞儀 LSRFortessaTM（美國 BD 公司）；化學(xué)發(fā)光儀 Amersham Imager 600 System（美國 GE 公司）；熒光定量 PCR 儀applied biosystems 7500（美國 ABI 公司）。1.1.2 方法1.1.2.1 CWA 蛋白截短位置的確定利用 CWA 蛋白使報告基因表面展示在新功能型植物乳桿表面。很多研究表明了 CWA 蛋白的功能，但其較長的序列（2118bp）影響新功能型植物乳桿菌的構(gòu)建和蛋白的定表達(dá)。因此本實驗利用 Lasergene 軟件推測 CWA 蛋白結(jié)構(gòu)和截取位點。根據(jù) CWA 蛋白表面可及性分析（圖 2-1），該蛋白的中后部分可能為主要的蛋白展示功能區(qū)，而前面大部分不易展示蛋白。結(jié)合該蛋白的疏水性和抗原指數(shù)分析，其第 1536 bp 至 2118 bp 處位點可能為潛在的外源蛋白展示位點，從實際操作的角度考慮，將錨定蛋白縮短更有利于蛋白的展示，選擇第 1536 堿基（512氨基酸位點）位點作為該蛋白的截短位點，共 582 個堿基。

圖 2-3 pSIP-409-0373-EGFP-CWA 雙酶切鑒定結(jié)果0 marker；1、3、5、7：新功能型質(zhì)粒；2、4、6、8： XbaI 物ig.2-3 Identification of pSIP-409-0373-EGFP-CWAby double dig00 marker; 1, 3, 5, 7: new functional plasmid; 2, 4, 6, 8: XbaI andproductstern Blot 檢測新功能型乳酸菌表面 EGFP 的表達(dá)情況estern Blot 檢測新功能型乳酸菌Lb.plantarum-409EC可見與預(yù)期大小相符的目的條帶。結(jié)果表明以 His 標(biāo)約有大小為 54 kDa 蛋白印跡；第 7 泳道為空菌對照（作為一抗，第 1 泳道，目的條帶為 54 kDa；第 2 道為型乳酸菌表面有 EGFP 表達(dá)（圖 2-4）。

圖 2-3 pSIP-409-0373-EGFP-CWA 雙酶切鑒定結(jié)果M1：DL10000 marker；1、3、5、7：新功能型質(zhì)粒；2、4、6、8： XbaI 和 Hind III 酶切物Fig.2-3 Identification of pSIP-409-0373-EGFP-CWAby double digestionM1：DL10000 marker; 1, 3, 5, 7: new functional plasmid; 2, 4, 6, 8: XbaI and Hind III digestioproducts1.2.2 Western Blot 檢測新功能型乳酸菌表面 EGFP 的表達(dá)情況通過 Western Blot 檢測新功能型乳酸菌Lb.plantarum-409EC表面 EGFP 表達(dá)水平，可見與預(yù)期大小相符的目的條帶。結(jié)果表明以 His 標(biāo)簽作為一抗，1-6 泳道，約有大小為 54 kDa 蛋白印跡；第 7 泳道為空菌對照（A）。以 EGF單克隆抗體作為一抗，第 1 泳道，目的條帶為 54 kDa；第 2 道為空菌對照（B顯示新功能型乳酸菌表面有 EGFP 表達(dá)（圖 2-4）。

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