【摘要】：根據(jù)CA Cancer J Clin的文章統(tǒng)計,2018年全球臨床癌癥的發(fā)病率中,乳腺癌居于女性惡性腫瘤發(fā)病率首位,在全球癌癥發(fā)病率中也僅次于肺癌,顯然乳腺癌是危害女性健康的第一大惡性腫瘤,其中Her2陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌(metastatic breast cancer,MBC)在晚期乳腺癌占比中達(dá)到25%。人表皮生長因子受體 2(human epidermal growth factor receptor 2,Her2/ErbB2)是一種具有酪氨酸酶活性的跨膜蛋白,Her2的過表達(dá)往往與許多上皮細(xì)胞癌癥的惡化密切相關(guān)。因此,將Her2作為靶位點治療乳腺癌成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點。目前靶向Her2抗體藥物主要有單克隆抗體、雙特異性抗體、抗體偶聯(lián)藥物等。美國FDA于1998年批準(zhǔn)了第一個用于Her2陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌(metastatic breast cancer,MBC)臨床治療的單克隆抗體藥物曲妥珠單抗(Herceptin(?))上市。傳統(tǒng)單抗一般選擇以具有天然活性蛋白的哺乳動物細(xì)胞為表達(dá)載體,以保證抗體蛋白的正確修飾和生物學(xué)活性。本研究選擇以轉(zhuǎn)基因山羊乳腺生物反應(yīng)器為抗體表達(dá)方式,構(gòu)建Anti-Her2乳腺特異性表達(dá)載體pDBC-Her2:含有兩個以山羊β-casein為啟動子和以牛BGH-PA為終止子的表達(dá)框。將Her2抗體的輕鏈與重鏈分別連入兩個表達(dá)框中,該表達(dá)載體可通過Cre/loxp重組酶系統(tǒng)將外源目的基因定位整合入人溶菌酶轉(zhuǎn)基因山羊細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染原代山羊乳腺上皮細(xì)胞后通過RT-PCR和Western Blot檢測其細(xì)胞水平的cDNA/蛋白的表達(dá),完成Anti-Her2乳腺特異性表達(dá)載體pDBC-Her2的構(gòu)建。將構(gòu)建完成的pDBC-Her2質(zhì)粒與pBS185質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人溶菌酶山羊成纖維細(xì)胞,利用嘌呤霉素加壓篩選獲得陽性克隆,通過PCR和測序的方式鑒定其目的基因是否定位整合,篩選獲得定位整合的陽性細(xì)胞株,同時也是制備轉(zhuǎn)基因山羊的體細(xì)胞核移植供體。選擇30頭2歲齡的健康母關(guān)中奶山羊,其中20頭為供體,10頭為受體,控制同步發(fā)情,經(jīng)過超數(shù)排卵和手術(shù)取卵后共獲得卵母細(xì)胞177個,融合后獲得重構(gòu)胚92枚,通過手術(shù)移植入10頭受體母羊體內(nèi)。在移植35天后進(jìn)行B超檢查,共檢查到2頭母羊出現(xiàn)孕囊,懷孕率20%(2/10)。剖腹取出40日齡的羊胎兒,通過PCR和測序方法鑒定,胎兒的基因成功定位整合Her2抗體基因,該羊為pDBC-Her2轉(zhuǎn)基因羊,為后續(xù)該轉(zhuǎn)基因羊的擴繁埋下基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S827
【圖文】：

本實驗室之前已獲得人溶菌酶轉(zhuǎn)基因山羊，其標(biāo)記基因框架為丨ｏｘｐｌ－ｎｅｏ－ＴＫ－ｌｏｘｐ，逡逑因此在此基礎(chǔ)上，設(shè)計ｍｔＬｏｘｐ－Ｈｅｒ２－ｐｕｒｏ－ｌｏｘｐ載體，這樣可以將Ｈｅｒ２目的基因定位整逡逑合入羊的基因中。置換方式示意圖如圖１－１。逡逑

１．材料與方法逡逑Ｕ材料逡逑羊Ｐ邋－ｃａｓｅｉｎ啟動子相關(guān)序列來源于ＧｅｎＢａｎｋ：邋ＡＨ００１１９５．２，牛ＢＧＨ－ＰＡ終止子相關(guān)逡逑序列來源于ＧｅｎＢａｎｋ：Ａ０５１３７．１。ｐＢＣ－ＰＡ質(zhì)粒由實驗室之前構(gòu)建并保存，Ｈｅｒ２輕鏈和重逡逑鏈序列來源于ＥＮＳＧ０００００１４１７３６。逡逑１．２數(shù)據(jù)分析軟件逡逑（１）邐Ｐｒｉｍｅｒ５．０，邋ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｍｉｅｒｂｉｏｓｏｆｔ．ｃｏｍ／ｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎ／逡逑（２）邐Ｃｈｒｏｍａｓ２．２．６？邋ｈｔｔｐｓ：／／ｃｈｒｏｍａｓ．ｕｐｄａｔｅｓｔａｒ．ｃｏｍ／逡逑２．邐結(jié)果逡逑２．１乳腺特異性表達(dá)載體ｐＤＢＣ－Ｈｅｒ２構(gòu)建逡逑ＤＢＣ－Ｈｅｒ２２－１。逡逑

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