【摘要】：球蟲耐藥性發(fā)展的普遍性及嚴重性已成為當前球蟲病防治中的主要障礙,各國學(xué)者對球蟲耐藥性產(chǎn)生的原因及機制都進行了研究,但球蟲耐藥性形成的機制至今不明,也沒有找到控制球蟲產(chǎn)生耐藥性的靶基因,還無法解釋雞球蟲耐藥性產(chǎn)生的分子機制。為了深入研究球蟲耐藥性產(chǎn)生的分子機制,實驗室前期在藥物選擇壓力下誘導(dǎo)獲得了柔嫩艾美耳球蟲馬杜拉霉素耐藥株和地克珠利耐藥株,利用RNA-sequence分析了這兩個耐藥株和敏感株的轉(zhuǎn)錄組,獲得了兩個耐藥株與敏感株的差異表達基因。本研究在此基礎(chǔ)上選擇了3個差異表達基因進行特性研究,包括2個耐藥株上調(diào)表達基因:NADP特異性谷氨酸脫氫酶(NADP-specific glutamate dehydrogenase,NADP-GDH)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD),1個耐藥株下調(diào)表達基因:表面抗原10(Surface antigen 10,SAG10)。1、3個基因的克隆及生物信息學(xué)分析以柔嫩艾美耳球蟲敏感株cDNA第一鏈為模板,成功克隆了柔嫩艾美耳球蟲表面抗原10(Et SAG10)基因,柔嫩艾美耳球蟲NADP特異性谷氨酸脫氫酶(EtNADP-GDH)基因和柔嫩艾美耳球蟲超氧化物歧化酶(EtSOD)基因。利用生物信息學(xué)技術(shù)對三個基因進行分析,結(jié)果顯示:Et SAG10基因開放閱讀框序列長786 bp,編碼261個氨基酸,預(yù)測分子質(zhì)量為27.9 kDa,等電點為4.7;信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)分析表明該基因編碼的蛋白具有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu),并含有多個功能位點,屬于表面抗原(SAG)家族。EtNADP-GDH基因開放閱讀框序列長1407 bp,編碼468個氨基酸,預(yù)測分子質(zhì)量為51.0 kDa,等電點為6.93;信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)分析表明該基因編碼的蛋白無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu),含有包括NAD結(jié)合位點在內(nèi)的多種功能位點。Et SOD基因開放閱讀框序列長651 bp,編碼216個氨基酸,預(yù)測分子質(zhì)量為24.9 kDa,等電點為7.15;信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)分析表明該基因編碼的蛋白無信號肽,無跨膜結(jié)構(gòu),但包括多種功能位點。2、3個基因的原核表達及特性初步分析將三個克隆的基因分別連接到原核表達載體,構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pGEX-4T-EtSAG10、pColdI-EtNADP-GDH、pET-28a-EtSOD,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中,成功誘導(dǎo)表達,獲得了相應(yīng)的重組蛋白GSTEtSAG10(rEtSAG10)、His-EtNADP-GDH(rEtNADP-GDH)和His-EtSOD(rEt SOD),且3個重組蛋白均為可溶性蛋白。利用重組蛋白分別免疫新西蘭大白兔和BALB/c小鼠,制備了相應(yīng)的多克隆抗體。免疫熒光定位和入侵抑制實驗分析了3個蛋白在蟲體中的分布以及是否參與蟲體入侵宿主細胞。定位分析發(fā)現(xiàn)EtSAG10主要分布在蟲體的表面和納蟲空泡膜(PVM)上,隨著蟲體在DF-1細胞中的發(fā)育,EtSAG10表達量增加。EtNADP-GDH主要分布在蟲體的表面和細胞質(zhì)中,隨著蟲體在DF-1細胞中的發(fā)育,熒光變?nèi)?EtNADP-GDH表達量出現(xiàn)下降,但發(fā)育為成熟裂殖體后表達量又發(fā)生了明顯的提升。EtSOD主要分布在子孢子入侵宿主細胞后蟲體的頂端和表面,隨著細胞內(nèi)蟲體的發(fā)育,EtSOD主要定位于未成熟裂殖體和成熟裂殖體的整個表面。入侵抑制實驗分析發(fā)現(xiàn)EtSAG10和EtNADP-GDH均與子孢子入侵宿主細胞有關(guān),抗體入侵抑制率分別達到60%和45%,而EtSOD對入侵作用不大。球蟲4個發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平分析顯示EtSAG10在孢子化卵囊階段轉(zhuǎn)錄水平最高;EtNADP-GDH在未孢子化卵囊階段轉(zhuǎn)錄水平最高;相比之下,EtSOD在第二代裂殖子階段轉(zhuǎn)錄水平最高。3、3個基因在柔嫩艾美耳球蟲敏感株與耐藥株之間的差異分析收集柔嫩艾美耳球蟲敏感株與地克珠利耐藥株、馬杜拉霉素耐藥株的蟲體,對三個基因進行轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的分析,結(jié)果顯示:EtSAG10在耐藥株中的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平均表現(xiàn)為明顯的下調(diào)。對不同濃度的地克珠利作用下誘導(dǎo)產(chǎn)生的柔嫩艾美耳球蟲耐藥株檢測發(fā)現(xiàn),其翻譯水平出現(xiàn)了不規(guī)則變化,隨著藥物濃度升高表現(xiàn)為先上升后下降。且在馬杜拉霉素不同濃度的作用下,其翻譯水平也出現(xiàn)先上升后下降。EtNADP-GDH在耐藥株與敏感株中的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平總體來說變化都不明顯,在使用不同濃度的藥物作用下,也并沒有引起該基因轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平的顯著變化。EtSOD在耐藥株中的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平出現(xiàn)明顯的上調(diào),對不同濃度的地克珠利作用下誘導(dǎo)產(chǎn)生的柔嫩艾美耳球蟲耐藥株檢測發(fā)現(xiàn),該基因的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平與藥物濃度呈正相關(guān)。對不同濃度的馬杜拉霉素作用下誘導(dǎo)產(chǎn)生的柔嫩艾美耳球蟲耐藥株進行檢測分析也發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果。另外,對EtNADP-GDH和EtSOD進行酶活分析發(fā)現(xiàn)EtNADP-GDH酶活性在三種蟲株中無明顯變化,但EtSOD在兩種耐藥株中酶活性明顯升高。
【學(xué)位授予單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.723
【圖文】：

BLAST 程序（http://www.ncbi.nlm/www.expasy.org/tools/protparam.html） http ： //octopus.cbr.su.se/index.phpch/cgi-bin/motif_scan）對 EtNADP-G蛋白質(zhì)的理論分子質(zhì)量、等電點、氨氨基酸序列的功能結(jié)構(gòu)域[53]。株孢子化卵囊蟲體的收集與純化艾美耳球蟲后，收集 6~8 d 的糞便，鉀溶液，在 28 ℃的條件下，對其通用飽和鹽水漂浮法和次氯酸鈉氧化法

柔嫩艾美耳球蟲敏感株孢子化卵囊的 cDNA 的第一鏈為模板，選擇度進行 PCR 擴增。瓊脂糖凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)擴增所得的條帶大小約為 1407 bp（圖 2-2C）。連接至克隆載體 pGEM-T-easy 載體，轉(zhuǎn)受態(tài)細胞 TOP10 后，使用質(zhì)粒小提試劑盒，按照其使用說明書提GEM-T-EtNADP-GDH，質(zhì)粒經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶 BamHI 和 SalI 雙凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)與預(yù)期一致的 2 條帶（圖 2-3），表明重-T-EtNADP-GDH 構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實驗。 EtSOD 基因的擴增及雙酶切驗證柔嫩艾美耳球蟲敏感株孢子化卵囊的 cDNA 的第一鏈為模板，選擇度進行 PCR 擴增。瓊脂糖凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)擴增所得的條帶大小約為 651 bp（圖 2-2D）。連接至克隆載體 pGEM-T-easy 載體，轉(zhuǎn)化態(tài)細胞 TOP10 后，使用質(zhì)粒小提試劑盒，按照其使用說明書提取M-T-EtSOD，質(zhì)粒經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶 BamHI 和 XhoI 雙酶切后，泳分析發(fā)現(xiàn)與預(yù)期一致的 2 條帶（圖 2-3），表明重組質(zhì)粒 pGEM-功，可用于后續(xù)實驗。

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本文編號：2738621