【摘要】：精子是一種遺傳物質(zhì)高度濃縮的細(xì)胞,由于其RNA的含量顯著低于卵母細(xì)胞,使得大多數(shù)科研工作者忽略了精子RNA的功能而將與胚胎發(fā)育相關(guān)的研究聚焦在了卵母細(xì)胞RNA。RNA組成性分析表明,精子RNA主要由mRNAs、miRNAs、tRNAs和siRNA組成,這些RNAs能通過受精過程隨精子進(jìn)入卵母細(xì)胞,暗示精源性miRNA與endo-siRNA在胚胎發(fā)育過程中扮演重要角色。因此,更深入探討精源性miRNAs的功能對我們擴(kuò)展早期胚胎發(fā)育事件及其調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識是十分必要的。本研究根據(jù)已有文章公布的miRNA測序數(shù)據(jù)以及本課題組構(gòu)建的牛精子small RNA文庫,初步篩選出bta-miR-301a作為研究對象。隨后利用實時熒光定量PCR檢測方法證實了bta-miR-301a為精源性miRNA。綜合多個數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-301a的靶基因,取交集后進(jìn)行基因聚類分析,選擇可信度較高的TGF-β通路的靶基因用于后續(xù)研究。通過靶基因mRNA物種保守性比對、3’-UTR結(jié)合位點查詢、MII期卵母細(xì)胞表達(dá)水平檢測以及雙熒光素酶報告基因檢測后,最終確定ACVR1為miR-301a的靶基因。熒光定量PCR結(jié)果顯示,體外受精組原核至2-細(xì)胞發(fā)育過程中,bta-miR-301a的表達(dá)量顯著下降,靶基因ACVR1的表達(dá)趨勢在孤雌組、核移植組及體外受精組胚胎中也存在差異。其中,在MII期卵母細(xì)胞至體外受精2-細(xì)胞發(fā)育階段,ACVR1的表達(dá)量顯著降低,而核移植組與孤雌組的表達(dá)量卻顯著升高。因此,暗示精子miR-301a可能靶向下調(diào)了體外受精組2-細(xì)胞時期ACVR1的表達(dá)。為了確定mi R-301a對牛早期胚胎發(fā)育的影響,對激活后的卵母細(xì)胞進(jìn)行了mi R-301a mimic的顯微注射試驗。與對照組相比,注射組孤雌胚胎2-細(xì)胞時期的ACVR1蛋白表達(dá)量顯著降低,第一次卵裂時間延長并且囊胚率升高。因此,推測2-細(xì)胞時期,mi R-301a能夠靶向調(diào)控ACVR1延長了第一次卵裂時間并影響后續(xù)囊胚的發(fā)育。綜上所述,本研究初步確定了精源性miR-301a能夠影響牛早期胚胎發(fā)育進(jìn)程。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S823
【圖文】：

分析各個靶基因的 CT 值，根據(jù) CT 值的大中的表達(dá)情況。1a 精源性驗證量 PCR 的檢測方法，分別測定了 MII 期卵母細(xì)胞、IV、SCNT 類原核期胚胎及 SCNT 2-細(xì)胞胚胎中 bta-miR-以 MII 期卵母細(xì)胞作為參照樣本，按照 2- Ct的計算方趨勢，并用 t 檢驗進(jìn)行差異性分析。結(jié)果如圖 3-1 所胚胎的相對表達(dá)量顯著高于 MII 期卵母細(xì)胞及 2-細(xì)胞在 SCNT 胚胎中，miR-301a 在類原核期的相對表達(dá)量顯)，但卻顯著高于 SCNT 2-細(xì)胞胚胎(P＜0.05)。urve Analysis1min Increment rate 0.5℃/s

a 在 MII 期卵母細(xì)胞、核移植類原核期胚胎及核移植 2-細(xì)胞胚同組間的顯著性差異(P＜0.05)。bundance of bta-miR-301a in MII oocytes; embryos of Pseudo-Prcell stage in SCNT. Different letters indicate differences (P <1a 靶基因預(yù)測及通路分析、TargetScan 與 PicTar 數(shù)據(jù)庫中 miR-301a 靶基因預(yù)測據(jù)庫中共有 361 個交集的靶基因。

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本文編號：2728300