【摘要】：哺乳動(dòng)物乳腺組織在哺育下一代時(shí)分泌乳汁為其成長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)以及免疫保護(hù),乳汁中的主要成分包括乳蛋白、乳脂肪、乳糖等,牛乳也是人類(lèi)生活中必不可少的優(yōu)質(zhì)食品。乳合成相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、調(diào)控乳合成的關(guān)鍵信號(hào)分子及其作用機(jī)制是畜牧學(xué)亦是生命科學(xué)研究的重要內(nèi)容。PURB是Pur蛋白家族中成員,Pur家族蛋白可以形成同型和異型復(fù)合物,并且特異性地以高親和力結(jié)合富含嘌呤的ssDNA(有義或反義)或RNA。它們優(yōu)先結(jié)合含有GGN(N不是G)重復(fù)序列。本研究前期發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)鞍彼?Met)刺激時(shí)牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)PURB表達(dá)量顯著增加,提示PURB作為轉(zhuǎn)錄因子可能對(duì)BMECs的乳的合成起調(diào)控作用。目前,國(guó)際上有關(guān)PURB的功能和作用機(jī)制的研究較少,尚無(wú)研究揭示PURB對(duì)BMEC乳合成是否發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)擬揭示PURB在氨基酸促進(jìn)BMECs乳蛋白和乳脂肪合成中的作用及其分子機(jī)理。本研究通過(guò)組織塊法培養(yǎng)和純化BMECs,得到的原代BMECs進(jìn)行傳代培養(yǎng),-80℃凍存?zhèn)溆�。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)速度,免疫熒光(IF)法鑒定細(xì)胞的純度:檢測(cè)細(xì)胞中β-酪蛋白(β-casein)和角蛋白18(Cytokeratin 18)的表達(dá)。在培養(yǎng)液中添加0.6 mmol/L Met或0.6 mmol/L Leu,qRT-PCR和western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明α-casein和β-casein表達(dá)量顯著提高。脂滴實(shí)驗(yàn)結(jié)果與甘油三酯(TG)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明,Met和Leu能夠顯著促進(jìn)BMECs乳脂肪的合成。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)成功地建立了氨基酸調(diào)節(jié)乳合成的體外細(xì)胞培養(yǎng)模型。qRT-PCR和western blotting結(jié)果表明PURB蛋白和mRNA的表達(dá)量在Met和Leu作用時(shí)顯著上升。IF檢測(cè)PURB的亞細(xì)胞定位,顯示PURB定位在胞核中,Met、Leu處理增強(qiáng)PURB在胞核中的定位。這些結(jié)果表明,Met和Leu能夠顯著促進(jìn)BMECs中PURB的表達(dá)和核定位,提示在Met和Leu上調(diào)乳蛋白和乳脂肪合成的過(guò)程中,PURB可能是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子。利用重組質(zhì)粒和siRNA對(duì)PURB基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)和干擾。PURB基因過(guò)表達(dá)時(shí),PURB、α-casein和β-casein表達(dá)量顯著提高,TG分泌和脂滴的合成顯著提高,mTOR磷酸化和SREBP-1c蛋白水平也顯著提高;PURB基因干擾時(shí),PURB、α-casein及β-casein表達(dá)量顯著降低,TG分泌和脂滴的合成顯著降低,mTOR磷酸化和SREBP-1c蛋白水平也顯著降低。以上研究結(jié)果表明,PURB具有正向調(diào)節(jié)mTOR和SREBP-1c信號(hào)分子從而促進(jìn)乳蛋白和乳脂肪合成的作用。為了探究PURB接受Met和Leu刺激從而調(diào)節(jié)乳合成的分子機(jī)制,應(yīng)用PI3K抑制劑沃曼青(wortmannin)抑制PI3K信號(hào)通路。Western blotting分析表明PI3K抑制完全阻斷了2種氨基酸對(duì)PURB表達(dá)的促進(jìn)作用。結(jié)果表明Met和Leu通過(guò)PI3K途徑促進(jìn)PURB蛋白表達(dá)。為進(jìn)一步探究PURB是否介導(dǎo)Met和Leu調(diào)節(jié)mTOR和SREBP-1c信號(hào)分子,細(xì)胞添加Met或Leu時(shí)同時(shí)轉(zhuǎn)染PURB siRNA。Western blotting分析表明PI3K抑制完全阻斷了兩種氨基酸對(duì)mTOR磷酸化和SREBP-1c蛋白水平的促進(jìn)作用。結(jié)果表明PURB介導(dǎo)Met和Leu調(diào)節(jié)mTOR和SREBP-1c信號(hào)途徑。采用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)-PCR和ChIP-qPCR鑒定PURB與mTOR、SREBP-1c基因的啟動(dòng)子(-1~-2 000bp)可能發(fā)生結(jié)合的位點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PURB與mTOR、SREBP-1c基因的啟動(dòng)子各存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。ChIP-qPCR結(jié)果顯示,Met和Leu刺激促進(jìn)PURB與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合。PURB基因過(guò)表達(dá)和干擾發(fā)現(xiàn)PURB正向調(diào)節(jié)mTOR和SREBP-1c的mRNA水平。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Met和Leu刺激PURB表達(dá)并促進(jìn)與PURB與mTOR、SREBP-1c的基因啟動(dòng)子結(jié)合,啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。已有研究提示PURB在基因轉(zhuǎn)錄中起著關(guān)鍵作用,但與許多其他轉(zhuǎn)錄因子相比,國(guó)際上發(fā)表的結(jié)果較少。本研究發(fā)現(xiàn)在BMECs中,PURB是牛乳腺細(xì)胞中乳蛋白和乳脂肪合成的正向調(diào)控因子。PURB位于細(xì)胞核,氨基酸(Met和Leu)通過(guò)PI3K信號(hào)途徑促進(jìn)PURB表達(dá)。PURB可以與mTOR和SREBP-1c基因啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄,Met和Leu刺激這種結(jié)合。PURB介導(dǎo)Met和Leu對(duì)mTOR和SREBP-1c表達(dá)的刺激,導(dǎo)致乳蛋白和乳脂肪合成增加。綜上,在BMECs中PURB介導(dǎo)Met和Leu信號(hào)促進(jìn)mTOR和SREBP-1c基因轉(zhuǎn)錄從而促進(jìn)乳蛋白和乳脂肪合成。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S852.2
【圖文】：

前 言合成途徑及調(diào)控機(jī)制成分組成的場(chǎng)所腺組織在哺育下一代時(shí)分泌乳汁為其成長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)以及免疫蛋白、乳脂肪、乳糖等，牛乳也是人類(lèi)生活中必不可少的種間差異，這些差異可能反映了哺乳期奶牛的生物化學(xué)代謝差異[2]。，乳突中乳腺上皮組織包含許多由腺泡（alveolus）組成的將乳汁排到乳頭[3]。每個(gè)小葉（如圖 1-1）包含由多個(gè)腺泡單位[4]。

含量和組成存在種間差異，這些差異可能反映了哺乳期奶牛的生物化學(xué)代謝過(guò)程和哺乳幼仔的營(yíng)養(yǎng)需求存在差異[2]。在哺乳期間，乳突中乳腺上皮組織包含許多由腺泡（alveolus）組成的小葉（lobule）并連接到輸乳管，將乳汁排到乳頭[3]。每個(gè)小葉（如圖 1-1）包含由多個(gè)腺泡（alveolus），這些小葉是乳汁分泌單位[4]。圖 1-1 乳汁分泌單位[4]Fig.1-1Milk secreting units腺泡由單層極化的腺泡乳腺上皮細(xì)胞（mammary epithelial cell, MEC）組成（如圖 1-2）排列在管腔周?chē)�，分泌乳汁。腺泡連接到由雙層乳腺上皮細(xì)胞形成的輸乳管[5]。腺泡 MEC 接觸基膜（basic membrane，BM），一種專(zhuān)門(mén)的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）并被收縮的肌上皮細(xì)胞（myoepithelial cell）包圍。乳腺小泡嵌入含有膠原、內(nèi)皮細(xì)胞（endothelicell）、脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞（fibroblast）的基質(zhì)中。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

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本文編號(hào)：2727301