【摘要】：乳腺是精密復(fù)雜的分泌器官。乳腺發(fā)育的不同階段需要細(xì)胞外基質(zhì)精細(xì)控制的降解和重塑,基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9,MMP9)被認(rèn)為是其中的關(guān)鍵酶,但是缺乏具體研究。為確定MMP9基因?qū)δ膛Ｈ橄偕掀ぜ?xì)胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)的作用及可能機(jī)理,本研究構(gòu)建MMP9基因過(guò)表達(dá)載體,以BMECs作為研究對(duì)象,采用基因過(guò)表達(dá)和基因沉默技術(shù),改變BMECs中MMP9的表達(dá),利用MTT法檢測(cè)BMECs的細(xì)胞增殖情況,利用甘油三酯檢測(cè)試劑盒檢測(cè)BMECs的甘油三酯含量的變化,利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BMECs的遷移情況。并通過(guò)Western blotting或qPCR法檢測(cè)β-酪蛋白及相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá),確定MMP9對(duì)BMECs的作用及可能機(jī)理;另外分別在BMECs中添加LY-294002、U0126或雷帕霉素,通過(guò)Western blotting檢測(cè)MMP9及相關(guān)信號(hào)通路分子的表達(dá),以確定各信號(hào)通路是否對(duì)MMP9基因表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。MMP9基因的過(guò)表達(dá)和沉默實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MMP9基因過(guò)表達(dá)時(shí)可顯著上調(diào)p-mTOR(P0.05)、mTOR(P0.05)、Bcl-2(P0.05)、Bcl-XL(P0.05)、E-Cadherin(P0.05)的表達(dá);MMP9還可以顯著提高細(xì)胞增殖能力(P0.05),顯著提高BMECs中β-酪蛋白(P0.05)和甘油三酯(P0.05)的合成,并顯著促進(jìn)BMECs遷移,但此時(shí)Bax(P0.05)和Bak(P0.05)表達(dá)量相對(duì)下降;MMP9基因沉默時(shí)所有指標(biāo)均與MMP9基因過(guò)表達(dá)時(shí)相反,推測(cè)MMP9基因能促進(jìn)BMECs增殖和遷移。在BMECs中分別添加信號(hào)通路抑制劑后結(jié)果顯示,LY-294002能顯著降低p-AKT(P0.05)、AKT(P0.05)、MMP9(P0.05)的蛋白表達(dá);雷帕霉素能顯著降低p-mTOR(P0.05)、mTOR(P0.05)、MMP9(P0.05)的蛋白表達(dá),;U0126能顯著降低p-ERK(P0.05)、ERK(P0.05)、MMP9(P0.05)的蛋白表達(dá)。推測(cè)PI3K/AKT/mTOR和MAPK信號(hào)通路能調(diào)節(jié)MMP9蛋白表達(dá)。綜上所述,MMP9基因能促進(jìn)BMECs增殖和遷移;其基因表達(dá)可被PI3K/AKT/mTOR和MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S823
【圖文】：

結(jié) 果上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)取奶牛乳腺上皮細(xì)胞原代細(xì)胞。培養(yǎng)約 3-5 天后，在光學(xué)顯微出，呈長(zhǎng)梭型。繼續(xù)培養(yǎng) 3-5 天后，乳腺上皮細(xì)胞開(kāi)始爬出細(xì)胞混合生長(zhǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)直至細(xì)胞達(dá)到 90%以上。利用兩種行細(xì)胞梯度消化，消化 2-3 次后獲得純的奶牛乳腺上皮細(xì)胞后，進(jìn)行傳代處理，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖 3-2.奶牛乳腺上皮細(xì)胞角蛋白 18 鑒定（200×）Fig. 3-2. Expression of cytokeratin 18 in cultured dairy cows mammary epithelial cells（200×3.2 MMP9 基因?qū)δ膛Ｈ橄偕掀ぜ?xì)胞的作用3.2.1 MMP9 基因過(guò)表達(dá)對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的作用3.2.1.1 MMP9 基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染將純化后的 MMP9 DNA進(jìn)行經(jīng) KpnI和 NotI位點(diǎn)的雙酶切，與質(zhì)粒 pcDNA3.1+（5400相連，得到表達(dá)載體 pcDNA3.1 -MMP9。表達(dá)載體 pcDNA3.1-MMP9 經(jīng) KpnI 和 NotI 雙切后分別得到清晰的兩個(gè)條帶，分別為 MMP9 基因和載體質(zhì)粒 pcDNA3.1+，在預(yù)期的位出現(xiàn)明顯的條帶（如圖 3-3.第 2 泳道），說(shuō)明真核表達(dá)載體 pcDNA3.1-MMP9 構(gòu)建成功。序結(jié)果與 Genebank 數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)，氨基酸無(wú)突變，同源性達(dá) 100%如圖 3-4。

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本文編號(hào)：2720714