【摘要】：禽腺病毒引起的包涵體肝炎和心包積水綜合征給我國的禽類養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。病毒感染前期,禽無明顯臨床癥狀,無法進(jìn)行早期治療,因此疫苗接種成為首選的免疫防治策略。本文旨在研制一種高效、安全的亞單位疫苗,以應(yīng)對禽腺病毒引起的感染。根據(jù)禽腺病毒的病原學(xué)研究,將抗原蛋白鎖定為衣殼五鄰體蛋白上的Fiber-2蛋白。為了使抗原發(fā)揮更強(qiáng)的免疫效力,挑選了細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ做為疫苗佐劑,聯(lián)合免疫后評價(jià)疫苗效力。首先,在昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒系統(tǒng)中進(jìn)行了Fiber-2的表達(dá)。將密碼子優(yōu)化后的Fiber-2序列插入至桿狀病毒載體Bacmid上,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Sf9細(xì)胞中,制備高滴度的病毒用于重組蛋白表達(dá)。使用雙向瓊脂擴(kuò)散法對重組蛋白進(jìn)行免疫原性檢測,結(jié)果顯示重組蛋白效價(jià)達(dá)到了 1:128,表現(xiàn)出良好的免疫原性。其次,在大腸桿菌系統(tǒng)中對細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ進(jìn)行表達(dá)。將密碼子優(yōu)化過的序列插入至pET28a(+)表達(dá)載體中,各種溫度下的表達(dá)測試均顯示目的蛋白以包涵體的形式存在于細(xì)胞裂解沉淀中,之后對兩種蛋白包涵體復(fù)性。復(fù)性結(jié)果顯示,重組chIL-2和chIFN-γ蛋白以可溶形式存在于緩沖液中。最后,我們將重組Fiber-2抗原和重組chIL-2、chIFN-γ分子佐劑制備疫苗免疫雞群進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)。單獨(dú)Fiber-2的免疫保護(hù)結(jié)果表明,50 μg呢的劑量可為雞群提供100%的保護(hù)效果。低劑量(10μg)Fiber-2蛋白與分子佐劑的聯(lián)合免疫結(jié)果表明,chIFN-γ的佐劑效果優(yōu)于chIL-2,兩者同時(shí)與低劑量Fiber-2蛋白聯(lián)合免疫對雞群的保護(hù)率同樣可達(dá)100%。
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.4
【圖文】：

圖１．１禽腺病毒Ｉ群的結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＦＡｄＶ－Ｉ．逡逑為３６邋ｋｂ線性雙鏈ＤＮＡ，衣殼蛋白由六鄰體、是Ｉ群禽腺病毒分型的依據(jù)；五鄰體上的纖突蛋定位點(diǎn)，負(fù)責(zé)體外血細(xì)胞凝集［７］。逡逑會在禽體內(nèi)復(fù)制但不引發(fā)疾病，大部分情況僅混合感染后，會加劇禽腺病毒的發(fā)病情況，影中真菌毒素污染的情況高于全球的平均水平，物中滋生大量曲霉。長期暴露在亞臨床水平的，使其對傳染性疾病更加敏感［８］。黃曲霉素與Ｆ積水癥狀。另外，混合感染會導(dǎo)致更嚴(yán)重的粘的死亡率［９］。逡逑

圖２．１邋Ｓｆ９細(xì)胞生長曲線逡逑Ｆｉｇ．邋２．１邋Ｔｈｅ邋ｃｅｌｌ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋Ｓｆ９邋ｃｅｌｌｓ．逡逑的搖瓶培養(yǎng)：細(xì)胞傳代前進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種密度為３￣５ｘｌ0５ｃ培養(yǎng)時(shí)裝液量占總體積的１／５左右，預(yù)留足夠的氧氣，將搖瓶上培養(yǎng)２？３天后，取樣，使用臺盼藍(lán)染色鏡檢計(jì)數(shù)密度及存為２４？３０邋ｈ，根據(jù)細(xì)胞密度數(shù)據(jù)與存活率判斷細(xì)胞的健康程度，例如以５ｘｌ0５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ的密度接種，３天后細(xì)胞計(jì)數(shù)，密度為４ｘｌ以上，則可進(jìn)行下一次傳代。逡逑凍存于液氮中保種。凍存培養(yǎng)基的配方為：８０％無血清培養(yǎng)基、％邋ＤＭＳＯ。凍存程序?yàn)椋哄义锨埃玻浚?#176;Ｃ預(yù)冷凍存所需培養(yǎng)基；逡逑搖瓶中細(xì)胞狀態(tài)（活力及密度），將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至１５或５０邋ｍｌ無菌心５邋ｍｉｎ獲取細(xì)胞沉淀；逡逑７

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本文編號：2720406